Имуномодулиращите метаболити са ключова характеристика на туморната микросреда (ТМЕ), но с малки изключения, тяхната идентичност остава до голяма степен неизвестна. Тук анализирахме тумори и Т-клетки от тумори и асцит на пациенти с високостепенен серозен карцином (ВГСК), за да разкрием метаболома на тези различни ТМЕ отделения. Асцитът и туморните клетки имат значителни разлики в метаболитите. В сравнение с асцита, тумор-инфилтриращите Т-клетки са значително обогатени с 1-метилникотинамид (MNA). Въпреки че нивото на MNA в Т-клетките е повишено, експресията на никотинамид N-метилтрансфераза (ензим, който катализира прехвърлянето на метилови групи от S-аденозилметионин към никотинамид) е ограничена до фибробласти и туморни клетки. Функционално, MNA индуцира Т-клетките да секретират тумор-промотиращия цитокин тумор некрозис фактор алфа. Следователно, получената от TME MNA допринася за имунната регулация на Т-клетките и представлява потенциална имунотерапевтична цел за лечение на рак при хора.
Метаболитите, получени от тумора, могат да имат силен инхибиращ ефект върху противотуморния имунитет и все повече доказателства показват, че те могат да служат и като ключова движеща сила за прогресията на заболяването (1). В допълнение към ефекта на Варбург, наскоро започнаха изследвания, целящи да характеризират метаболитното състояние на туморните клетки и връзката му с имунното състояние на туморната микросреда (TME). Проучвания върху миши модели и човешки Т-клетки показват, че метаболизмът на глутамин (2), оксидативният метаболизъм (3) и метаболизмът на глюкозата (4) могат да действат независимо върху различни подгрупи на имунните клетки. Няколко метаболита в тези пътища инхибират противотуморната функция на Т-клетките. Доказано е, че блокирането на коензима тетрахидробиоптерин (BH4) може да увреди пролиферацията на Т-клетките, а увеличаването на BH4 в организма може да засили противотуморния имунен отговор, медииран от CD4 и CD8. Освен това, имуносупресивният ефект на кинуренина може да бъде възстановен чрез прилагане на BH4 (5). При глиобластом с мутант на изоцитрат дехидрогеназа (IDH), секрецията на енантиометаболичен (R)-2-хидроксиглутарат (R-2-HG) инхибира активирането, пролиферацията и цитолизната активност на Т-клетките (6). Наскоро беше показано, че метилглиоксал, страничен продукт на гликолизата, се произвежда от супресорни клетки с миелоиден произход и Т-клетъчният трансфер на метилглиоксал може да инхибира ефекторната Т-клетка. При лечение, неутрализацията на метилглиоксал може да преодолее активността на супресорни клетки, получени от миелоиди (MDSC), и синергично да подобри терапията с блокада на контролни точки при миши модели (7). Тези проучвания колективно подчертават ключовата роля на метаболитите, получени от TME, в регулирането на функцията и активността на Т-клетките.
Т-клетъчна дисфункция е широко докладвана при рак на яйчниците (8). Това се дължи отчасти на метаболитните характеристики, присъщи на хипоксията и анормалната туморна васкулатура (9), което води до превръщането на глюкозата и триптофана в странични продукти като млечна киселина и кинуренин. Прекомерният екстрацелуларен лактат намалява производството на интерферон-γ (IFN-γ) и стимулира диференциацията на миелосупресивните подгрупи (10, 11). Консумацията на триптофан директно инхибира Т-клетъчната пролиферация и инхибира сигнализацията на Т-клетъчните рецептори (12-14). Въпреки тези наблюдения, много работа, свързана с имунния метаболизъм, е проведена в in vitro Т-клетъчни култури с използване на оптимизирана среда или е ограничена до хомоложни миши модели in vivo, нито едно от които не отразява напълно хетерогенността на човешкия рак и физиологичната макро- и микросреда.
Честа характеристика на рака на яйчниците е перитонеалното разпространение и появата на асцит. Натрупването на клетъчна течност в асцит е свързано с напреднало заболяване и лоша прогноза (15). Според доклади, това уникално отделение е хипоксично, има високи нива на съдов ендотелен растежен фактор (VEGF) и индоламин 2,3-диоксигеназа (IDO) и е инфилтрирано от Т-регулаторни клетки и миелоидни инхибиторни клетки (15-18). Метаболитната среда на асцит може да е различна от тази на самия тумор, така че препрограмирането на Т-клетките в перитонеалното пространство е неясно. Освен това, ключовите разлики и хетерогенност между асцит и метаболити, присъстващи в туморната среда, могат да възпрепятстват инфилтрацията на имунните клетки и тяхната функция върху туморите и са необходими допълнителни изследвания.
За да решим тези проблеми, ние разработихме чувствителен метод за клетъчно разделяне и течна хроматография с тандемна масспектрометрия (LC-MS/MS), за да изследваме различни клетъчни типове (включително CD4+ и CD8+ Т-клетки), както и в рамките на и между туморите. Неговите метаболити обхващат клетки в една и съща асцитна и туморна среда на пациента. Използваме този метод в комбинация с високоразмерна поточна цитометрия и едноклетъчно РНК секвениране (scRNA-seq), за да предоставим висококачествен портрет на метаболитния статус на тези ключови популации. Този метод разкри значително повишаване на нивото на 1-метилникотинамид (MNA) в туморните Т-клетки, а in vitro експериментите показаха, че имуномодулиращият ефект на MNA върху функцията на Т-клетките е бил неизвестен досега. Като цяло, този метод разкрива взаимните метаболитни взаимодействия между туморите и имунните клетки и предоставя уникална информация за метаболитите на имунната регулация, което може да бъде полезно за лечение на Т-клетъчна имунотерапия при рак на яйчниците. Възможности за лечение.
Използвахме високоразмерна флоуцитометрия, за да определим едновременно количествено усвояването на глюкоза [2-(N-(7-нитрофенил-2-окса-1,3-диаза-4-ил)амино)-2-деоксиглюкоза (2-NBDG) и митохондриалната активност [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) са типични маркери, които разграничават имунните клетки и популациите от туморни клетки (Таблица S2 и Фигура S1A). Този анализ показа, че в сравнение с Т-клетките, асцитните и туморните клетки имат по-високи нива на усвояване на глюкоза, но имат по-малки разлики в митохондриалната активност. Средното усвояване на глюкоза от туморните клетки [CD45-EpCAM (EpCAM)+] е три до четири пъти по-голямо от това на Т-клетките, а средното усвояване на глюкоза от CD4+ Т-клетките е 1,2 пъти по-голямо от това на CD8+ Т-клетките, което показва, че туморно-инфилтриращите лимфоцити (TIL) имат различни метаболитни изисквания дори в един и същ туморен ендокрин (Фигура 1A). За разлика от това, митохондриалната активност в туморните клетки е подобна на тази на CD4+ Т клетките, а митохондриалната активност и на двата типа клетки е по-висока от тази на CD8+ Т клетките (Фигура 1B). Като цяло, тези резултати разкриват метаболитно ниво. Метаболитната активност на туморните клетки е по-висока от тази на CD4+ Т клетките, а метаболитната активност на CD4+ Т клетките е по-висока от тази на CD8+ Т клетките. Въпреки тези ефекти между клетъчните типове, няма постоянна разлика в метаболитния статус на CD4+ и CD8+ Т клетките или техните относителни пропорции в асцит в сравнение с туморите (Фигура 1C). За разлика от това, във фракцията CD45-клетките, делът на EpCAM+ клетките в тумора се е увеличил в сравнение с асцит (Фигура 1D). Наблюдавахме също ясна метаболитна разлика между EpCAM+ и EpCAM- клетъчните компоненти. EpCAM+ (туморните) клетки имат по-високо усвояване на глюкоза и митохондриална активност от EpCAM- клетките, което е много по-високо от метаболитната активност на фибробластите в туморните клетки при TME (Фигура 1, E и F).
(A и B) Медианен интензитет на флуоресценция (MFI) на усвояването на глюкоза (2-NBDG) (A) и митохондриална активност на CD4 + T клетки (MitoTracker тъмночервен) (B) Представителни графики (вляво) и таблични данни (вдясно), CD8 + T клетки и EpCAM + CD45-туморни клетки от асцит и тумор. (C) Съотношението на CD4 + и CD8 + клетки (на CD3 + T клетки) в асцит и тумор. (D) Пропорция на EpCAM + туморни клетки в асцит и тумор (CD45−). (E и F) EpCAM + CD45-тумор и EpCAM-CD45-матрично усвояване на глюкоза (2-NBDG) (E) и митохондриална активност (MitoTracker тъмночервен) (F) Представителни графики (вляво) и таблични данни (вдясно) Асцит и туморни клетки. (G) Представителни графики на експресията на CD25, CD137 и PD1 чрез флуоцитометрия. (H и I) Експресия на CD25, CD137 и PD1 върху CD4+ Т клетки (H) и CD8+ Т клетки (I). (J и K) Наивни, централно-паметни (Tcm), ефекторни (Teff) и ефекторно-паметни (Tem) фенотипове, базирани на експресията на CCR7 и CD45RO. Представителни изображения (вляво) и таблични данни (вдясно) на CD4+ Т клетки (J) и CD8+ Т клетки (K) в асцит и тумори. P стойности, определени чрез сдвоен t-тест (*P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001). Линията представлява съответстващи пациенти (n = 6). FMO, флуоресценция минус едно; MFI, медианен интензитет на флуоресценция.
По-нататъшен анализ разкри други значителни разлики между фенотипния статус на Т-клетките с висока разделителна способност. Активираната (Фигура 1, G до I) и ефекторната памет (Фигура 1, J и K) в туморите са много по-чести от асцитните (пропорция на CD3+ Т-клетки). По подобен начин, анализът на фенотипа чрез експресията на маркери за активиране (CD25 и CD137) и маркери за изчерпване [протеин на програмирана клетъчна смърт 1 (PD1)] показа, че въпреки че метаболитните характеристики на тези популации са различни (Фигура S1, B до E), не са наблюдавани значителни метаболитни разлики между наивни, ефекторни или мемори подгрупи (Фигура S1, F до I). Тези резултати бяха потвърдени чрез използване на методи за машинно обучение за автоматично определяне на клетъчни фенотипове (21), което допълнително разкри наличието на голям брой клетки от костен мозък (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) в асцита на пациента (Фигура S2A). Сред всички идентифицирани клетъчни типове, тази миелоидна клетъчна популация показа най-високо усвояване на глюкоза и митохондриална активност (Фигура S2, B до G). Тези резултати подчертават силните метаболитни разлики между множеството клетъчни типове, открити в асцит и тумори при пациенти с HGSC.
Основното предизвикателство при разбирането на метабономните характеристики на TIL е необходимостта от изолиране на Т-клетъчни проби с достатъчна чистота, качество и количество от тумори. Последните проучвания показват, че методите за сортиране и обогатяване с перли, базирани на флоуцитометрия, могат да доведат до промени в клетъчните метаболити (22-24). За да преодолеем този проблем, оптимизирахме метода за обогатяване с перли, за да изолираме и изолираме TIL от хирургично резециран човешки рак на яйчниците преди анализ чрез LC-MS/MS (вижте Материали и методи; Фигура 2А). За да оценим цялостното въздействие на този протокол върху метаболитните промени, сравнихме метаболитните профили на Т-клетките, активирани от здрави донори след горната стъпка на разделяне на перлите, с клетки, които не бяха разделени с перли, а останаха върху лед. Този анализ за контрол на качеството установи, че има висока корелация между тези две условия (r = 0,77) и техническата повторяемост на групата от 86 метаболита е с висока повторяемост (Фигура 2B). Следователно, тези методи могат да извършват точен метаболитен анализ в клетки, подложени на обогатяване на клетъчен тип, като по този начин осигуряват първата платформа с висока резолюция за идентифициране на специфични метаболити в HGSC, като по този начин дават възможност на хората да получат по-задълбочено разбиране за клетъчната специфичност на програмата за сексуален метаболизъм.
(A) Схематична диаграма на обогатяване с магнитни перли. Преди анализ чрез LC-MS/MS, клетките ще преминат през три последователни цикъла на обогатяване с магнитни перли или ще останат върху лед. (B) Ефектът от вида обогатяване върху количеството на метаболитите. Средната стойност на три измервания за всеки вид обогатяване ± SE. Сивата линия представлява съотношение 1:1. Вътрекласовата корелация (ICC) на повтарящите се измервания е показана в етикета на оста. NAD, никотинамид аденин динуклеотид. (C) Схематична диаграма на работния процес на анализ на метаболитите на пациента. Асцит или тумори се събират от пациентите и се криоконсервират. Малка част от всяка проба е анализирана чрез флуоцитометрия, докато останалите проби са претърпели три цикъла на обогатяване за CD4+, CD8+ и CD45- клетки. Тези клетъчни фракции са анализирани с помощта на LC-MS/MS. (D) Топлинна карта на стандартизирано количество на метаболитите. Дендрограмата представлява клъстерирането на Уорд на евклидови разстояния между пробите. (E) Анализ на главните компоненти (PCA) на метаболитна карта на пробата, показващ три повторения на всяка проба, пробите от един и същ пациент са свързани с линия. (F) PCA на метаболитния профил на пробата, обусловен от пациента (т.е. използвайки частична излишък); типът на пробата е ограничен от изпъкналата обвивка. PC1, основен компонент 1; PC2, основен компонент 2.
След това приложихме този метод за обогатяване, за да анализираме 99 метаболита във фракциите CD4+, CD8+ и CD45-клетки в първичния асцит и тумори на шестима пациенти с HGSC (Фигура 2C, Фигура S3A и Таблица S3 и S4). Популацията от интерес представлява от 2% до 70% от оригиналната голяма проба от живи клетки, а делът на клетките варира значително между пациентите. След отделяне на гранулите, обогатената фракция от интерес (CD4+, CD8+ или CD45-) представлява средно повече от 85% от всички живи клетки в пробата. Този метод за обогатяване ни позволява да анализираме клетъчни популации от метаболизма на човешка туморна тъкан, което е невъзможно да се направи от големи проби. Използвайки този протокол, определихме, че l-кинуренин и аденозин, тези два добре характеризирани имуносупресивни метаболита, са повишени в туморните Т-клетки или туморните клетки (Фигура S3, B и C). Следователно, тези резултати демонстрират прецизността и способността на нашата технология за клетъчно разделяне и масспектрометрия да открива биологично важни метаболити в тъканите на пациентите.
Нашият анализ също така разкри силно метаболитно разделение на клетъчните типове в рамките на и между пациентите (Фигура 2D и Фигура S4A). По-специално, в сравнение с други пациенти, пациент 70 показа различни метаболитни характеристики (Фигура 2E и Фигура S4B), което показва, че може да има значителна метаболитна хетерогенност между пациентите. Заслужава да се отбележи, че в сравнение с други пациенти (1,2 до 2 литра; Таблица S1), общото количество асцит, събран при пациент 70 (80 ml), е по-малко. Контролът на хетерогенността между пациентите по време на анализа на главните компоненти (например, използвайки анализ на частична излишък) показва постоянни промени между клетъчните типове, а клетъчните типове и/или микросредата са ясно агрегирани според метаболитния профил (Фигура 2F). Анализът на единичните метаболити подчертава тези ефекти и разкрива значителни разлики между клетъчните типове и микросредата. Заслужава да се отбележи, че най-екстремната наблюдавана разлика е MNA, която обикновено е обогатена с CD45- клетки и с CD4+ и CD8+ клетки, които инфилтрират тумора (Фигура 3A). За CD4+ клетките този ефект е най-очевиден, а MNA в CD8+ клетките също изглежда силно повлияна от околната среда. Това обаче не е важно, тъй като само трима от шестте пациенти могат да бъдат оценени за туморни CD8+ резултати. В допълнение към MNA, в различните видове клетки в асцит и тумори, други метаболити, които са слабо характеризирани при TIL, също са различно богати (Фигури S3 и S4). Следователно, тези данни разкриват обещаващ набор от имуномодулиращи метаболити за по-нататъшни изследвания.
(A) Нормализирано съдържание на MNA в CD4+, CD8+ и CD45- клетки от асцит и тумор. Диаграмата показва медианата (линия), интерквартилния диапазон (рамкова панта) и диапазона на данните, до 1,5 пъти интерквартилния диапазон (рамкова нишка). Както е описано в „Материали и методи за пациенти“, използвайте стойността на лимата на пациента, за да определите P стойността (*P<0,05 и **P<0,01). (B) Схематична диаграма на метаболизма на MNA (60). Метаболити: S-аденозил-1-метионин; SAH, S-аденозин-1-хомоцистеин; NA, никотинамид; MNA, 1-метилникотинамид; 2-PY, 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид; 4-PY, 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид; NR, никотинамид рибоза; NMN, никотинамид мононуклеотид. Ензими (зелено): NNMT, никотинамид N-метилтрансфераза; SIRT, сиртуини; NAMPT, никотинамид фосфорибозилтрансфераза; AOX1, алдехид оксидаза 1; NRK, никотинамид рибозид киназа; NMNAT, никотинамид мононуклеотид аденилат трансфераза; Pnp1, пурин нуклеозид фосфорилаза. (C) t-SNE на scRNA-seq на асцит (сиво) и тумор (червено; n = 3 пациенти). (D) Експресия на NNMT в различни клетъчни популации, идентифицирани с помощта на scRNA-seq. (E) Експресия на NNMT и AOX1 в SK-OV-3, човешки ембрионален бъбрек (HEK) 293T, Т-клетки и Т-клетки, третирани с MNA. Показана е сгънатата експресия спрямо SK-OV-3. Показан е моделът на експресия със SEM (n = 6 здрави донори). Ct стойности по-големи от 35 се считат за неоткриваеми (UD). (F) Експресия на SLC22A1 и SLC22A2 в SK-OV-3, HEK293T, Т-клетки и Т-клетки, третирани с 8mM MNA. Показана е сгънатата експресия спрямо SK-OV-3. Показан е моделът на експресия със SEM (n = 6 здрави донори). Ct стойности по-големи от 35 се считат за неоткриваеми (UD). (G) Съдържание на клетъчен MNA в активирани здрави донорски Т-клетки след 72 часа инкубация с MNA. Показан е моделът на експресия със SEM (n = 4 здрави донори).
MNA се произвежда чрез прехвърляне на метиловата група от S-аденозил-1-метионин (SAM) към никотинамид (NA) чрез никотинамид N-метилтрансфераза (NNMT; Фигура 3B). NNMT е свръхекспресиран в различни човешки ракови заболявания и е свързан с пролиферация, инвазия и метастази (25-27). За да разберем по-добре източника на MNA в Т-клетките при TME, използвахме scRNA-seq, за да характеризираме експресията на NNMT в различните клетъчни типове в асцит и тумори на трима пациенти с HGSC (Таблица S5). Анализът на приблизително 6500 клетки показа, че в асцит и туморна среда експресията на NNMT е ограничена до предполагаемите популации от фибробласти и туморни клетки (Фигура 3, C и D). Струва си да се отбележи, че няма очевидна експресия на NNMT в никоя популация, която експресира PTPRC (CD45+) (Фигура 3D и Фигура S5A), което показва, че MNA, открит в метаболитния спектър, е въведен в Т-клетките. Експресията на алдехид оксидаза 1 (AOX1) превръща MNA в 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид (2-PYR) или 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид (4-PYR); Фигура 3B) също е ограничена до популацията от фибробласти, експресиращи COL1A1 (Фигура S5A), което заедно показва, че Т-клетките нямат способността за конвенционален метаболизъм на MNA. Моделът на експресия на тези гени, свързани с MNA, беше потвърден с помощта на втори независим набор от клетъчни данни от асцит от пациенти с HGSC (Фигура S5B; n = 6) (16). Освен това, количествен анализ на полимеразно-верижна реакция (qPCR) на здрави донорски Т-клетки, третирани с MNA, показа, че в сравнение с контролните SK-OV-3 туморни клетки на яйчниците, NNMT или AOX1 почти не се експресират (Фигура 3E). Тези неочаквани резултати показват, че MNA може да се секретира от фибробласти или тумори в съседни Т-клетки при TME.
Въпреки че кандидатите включват семейството на органични катионни транспортери 1 до 3 (OCT1, OCT2 и OCT3), кодирани от семейството разтворими носители 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 и SLC22A3), потенциалните транспортери на MNA все още са неопределени (28). QPCR на mRNA от здрави донорски Т-клетки показва ниски нива на експресия на SLC22A1, но неоткриваеми нива на SLC22A2, което потвърждава, че е било докладвано преди това в литературата (Фигура 3F) (29). За разлика от това, клетъчната линия на овариален тумор SK-OV-3 експресира високи нива и на двата транспортера (Фигура 3F).
За да се тества възможността Т-клетките да абсорбират чужда MNA, здрави донорски Т-клетки бяха култивирани в продължение на 72 часа в присъствието на различни концентрации на MNA. При липса на екзогенна MNA, клетъчното съдържание на MNA не може да бъде открито (Фигура 3G). Активираните Т-клетки, третирани с екзогенна MNA, обаче показаха дозозависимо увеличение на съдържанието на MNA в клетките, до 6 mM MNA (Фигура 3G). Този резултат показва, че въпреки ниското ниво на експресия на транспортерите и липсата на основния ензим, отговорен за вътреклетъчния метаболизъм на MNA, TIL все още може да поеме MNA.
Спектърът на метаболитите в Т-клетките на пациентите и in vitro експериментите с абсорбция на MNA увеличават вероятността фибробластите, свързани с рака (CAF), да секретират MNA и туморните клетки да регулират фенотипа и функцията на TIL. За да се определи ефектът на MNA върху Т-клетките, здрави донорски Т-клетки бяха активирани in vitro в присъствието или отсъствието на MNA и бяха оценени тяхната пролиферация и производство на цитокини. След 7 дни добавяне на MNA в най-високата доза, броят на удвояване на популацията беше умерено намален, докато жизнеността се запази при всички дози (Фигура 4А). Освен това, лечението с екзогенен MNA доведе до увеличаване на дела на CD4+ и CD8+ Т-клетки, експресиращи тумор некрозис фактор-α (TNFα; Фигура 4B). За разлика от това, вътреклетъчното производство на IFN-γ беше значително намалено в CD4+ Т-клетките, но не и в CD8+ Т-клетките, и не се наблюдаваше значителна промяна в интерлевкин 2 (IL-2; Фигура 4, C и D). Следователно, ензимно-свързаният имуносорбентен анализ (ELISA) на супернатанти от тези третирани с MNA Т-клетъчни култури показа значително увеличение на TNFα, намаление на IFN-γ и никаква промяна в IL-2 (Фигура 4, E до G). Намаляването на IFN-γ показва, че MNA може да играе роля в инхибирането на противотуморната активност на Т-клетките. За да се симулира ефектът на MNA върху цитотоксичността, медиирана от Т-клетките, химерни антигенни рецепторни Т (FRα-CAR-T) клетки, насочени към фолатен рецептор α и CAR-T (GFP), регулирани от зелен флуоресцентен протеин (GFP)-CAR-T) клетки, се произвеждат от здрави донорски периферни кръвни мононуклеарни клетки (PBMC). CAR-T клетките са култивирани в продължение на 24 часа в присъствието на MNA и след това са ко-култивирани с човешки SK-OV-3 туморни клетки на яйчниците, експресиращи фолатен рецептор α при съотношение ефектор към мишена 10:1. Лечението с MNA доведе до значително намаляване на убиващата активност на FRα-CAR-T клетките, което беше подобно на FRα-CAR-T клетките, третирани с аденозин (Фигура 4H).
(A) Общ брой жизнеспособни клетки и удвояване на популацията (PD) директно от културата на 7-ия ден. Стълбовидната диаграма представлява средната стойност + SEM на шест здрави донора. Представлява данни от поне n = 3 независими експеримента. (B до D) CD3/CD28 и IL-2 бяха използвани за активиране на Т-клетки при съответните им концентрации на MNA в продължение на 7 дни. Преди анализа клетките бяха стимулирани с PMA/йономицин с GolgiStop в продължение на 4 часа. Експресия на TNFα (B) в Т-клетки. Примерно изображение (вляво) и таблични данни (вдясно) на експресията на TNFα в живи клетки. Експресия на IFN-γ (C) и IL-2 (D) в Т-клетки. Експресията на цитокини беше измерена чрез флуоцитометрия. Стълбовидната диаграма представлява средната стойност (n = 6 здрави донори) + SEM. Използвайте еднофакторен дисперсионен анализ и повтарящи се измервания (*P<0,05 и **P<0,01), за да определите P стойността. Представлява данни от поне n = 3 независими експеримента. (E до G) CD3/CD28 и IL-2 бяха използвани за активиране на Т клетки при съответните им концентрации на MNA в продължение на 7 дни. Средата беше събрана преди и след 4 часа стимулация с PMA/йономицин. Концентрациите на TNFα (E), IFN-γ (F) и IL-2 (G) бяха измерени чрез ELISA. Стълбовидната графика представлява средната стойност (n = 5 здрави донори) + SEM. P стойността беше определена с помощта на еднофакторен дисперсионен анализ и многократни измервания (*P<0,05). Пунктираната линия показва границата на откриване. (H) Анализ на клетъчен лизис. FRα-CAR-T или GFP-CAR-T клетките бяха коригирани с аденозин (250μM) или MNA (10 mM) в продължение на 24 часа или оставени нетретирани (Ctrl). Процентът на убиване на SK-OV-3 клетки беше измерен. P стойността беше определена чрез t-тест на Welch (*P<0,5 и **P<0,01).
За да се получи механистично разбиране на MNA-зависимата регулация на експресията на TNFα, бяха оценени промените в TNFα mRNA на третирани с MNA Т-клетки (Фигура 5А). Здрави донорски Т-клетки, третирани с MNA, показаха двукратно увеличение на нивата на транскрипция на TNFα, което показва, че MNA е зависим от транскрипционната регулация на TNFα. За да се изследва този възможен регулаторен механизъм, два известни транскрипционни фактора, които регулират TNFα, а именно активиран Т-клетъчен ядрен фактор (NFAT) и специфичен протеин 1 (Sp1), бяха оценени в отговор на свързването на MNA с проксималния TNFα промотор (30). TNFα промоторът съдържа 6 идентифицирани NFAT свързващи места и 2 Sp1 свързващи места, припокриващи се в едно място [-55 базови двойки (bp) от 5'-капачката] (30). Имунопреципитацията с хроматин (ChIP) показа, че при третиране с MNA, свързването на Sp1 с TNFα промотора се увеличава три пъти. Включването на NFAT също се увеличава и достига значение (Фигура 5B). Тези данни показват, че MNA регулира експресията на TNFα чрез Sp1 транскрипция и в по-малка степен експресията на NFAT.
(A) В сравнение с Т-клетки, култивирани без MNA, промяната в експресията на TNFα в Т-клетки, третирани с MNA, е кратността. Показан е моделът на експресия със SEM (n = 5 здрави донори). Представя данни от поне n = 3 независими експеримента. (B) TNFα промоторът на Т-клетки, третирани със или без 8 mM MNA, след като NFAT и Sp1 бяха комбинирани с (Ctrl) и PMA/йономицин стимулация в продължение на 4 часа. Имуноглобулин G (IgG) и H3 бяха използвани съответно като отрицателни и положителни контроли за имунопреципитация. Количественото определяне на ChIP показа, че свързването на Sp1 и NFAT към TNFα промотора в третираните с MNA клетки се е увеличило няколко пъти в сравнение с контролата. Представя данни от поне n = 3 независими експеримента. P стойност, определена чрез множество t-тестове (*** P <0,01). (C) В сравнение с асцита на HGSC, Т-клетките (нецитотоксични) показват повишена експресия на TNF в тумора. Цветовете представляват различни пациенти. Показаните клетки са били произволно семплирани до 300 и са били разклатени, за да се ограничи преизвличането (** Padj = 0.0076). (D) Предложен модел на MNA за рак на яйчниците. MNA се произвежда в туморни клетки и фибробласти в TME и се поема от Т клетки. MNA увеличава свързването на Sp1 с TNFα промотора, което води до повишена TNFα транскрипция и TNFα цитокини. MNA също така причинява намаляване на IFN-γ. Инхибирането на функцията на Т клетките води до намалена способност за убиване и ускорен растеж на тумора.
Според доклади, TNFα има предно- и задно-зависими противотуморни и противотуморни ефекти, но има добре позната роля в насърчаването на растежа и метастазите на рак на яйчниците (31-33). Според доклади, концентрацията на TNFα в асцит и туморни тъкани при пациенти с рак на яйчниците е по-висока, отколкото в доброкачествени тъкани (34-36). По отношение на механизма, TNFα може да регулира активирането, функцията и пролиферацията на белите кръвни клетки и да променя фенотипа на раковите клетки (37, 38). В съответствие с тези открития, диференциалният анализ на генната експресия показа, че TNF е значително повишен в Т-клетките в туморните тъкани в сравнение с асцит (Фигура 5C). Увеличението на експресията на TNF е наблюдавано само в Т-клетъчни популации с нецитотоксичен фенотип (Фигура S5A). В обобщение, тези данни подкрепят мнението, че MNA има двойни имуносупресивни и тумор-промотиращи ефекти при HGSC.
Флуоресцентното маркиране, базирано на флоуцитометрия, се е превърнало в основен метод за изучаване на метаболизма на TIL. Тези проучвания показват, че в сравнение с лимфоцитите от периферна кръв или Т-клетките от вторични лимфоидни органи, мишите и човешките TIL имат по-висока склонност към усвояване на глюкоза (4, 39) и постепенна загуба на митохондриална функция (19, 40). Въпреки че в това проучване наблюдаваме подобни резултати, ключовото развитие е да се сравни метаболизмът на туморните клетки и TIL от една и съща резецирана туморна тъкан. В съответствие с някои от тези предишни доклади, туморните (CD45-EpCAM+) клетки от асцит и тумори имат по-високо усвояване на глюкоза от CD8+ и CD4+ Т-клетките, което подкрепя, че високото усвояване на глюкоза от туморните клетки може да се сравни с Т-клетките. Концепцията за Т-клетъчната конкуренция. TME. Митохондриалната активност на туморните клетки обаче е по-висока от тази на CD8+ Т-клетките, но митохондриалната активност е подобна на тази на CD4+ Т-клетките. Тези резултати подсилват възникващата тема, че оксидативният метаболизъм е важен за туморните клетки (41, 42). Те също така предполагат, че CD8+ Т клетките може да са по-податливи на оксидативна дисфункция от CD4+ Т клетките или че CD4+ Т клетките може да използват източници на въглерод, различни от глюкоза, за да поддържат митохондриалната активност (43, 44). Трябва да се отбележи, че не наблюдавахме разлика в усвояването на глюкоза или митохондриалната активност между CD4+ Т ефектори, Т ефекторни паметни Т клетки и Т централни паметни Т клетки в асцит. По подобен начин, диференциационното състояние на CD8+ Т клетките в туморите няма нищо общо с промените в усвояването на глюкоза, което подчертава значителната разлика между Т клетки, култивирани in vitro, и човешки TIL in vivo (22). Тези наблюдения бяха потвърдени и чрез използването на безпристрастно автоматично разпределение на клетъчната популация, което допълнително разкри, че CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ клетки с по-високо усвояване на глюкоза и митохондриална активност от туморните клетки са преобладаващи, но имат метаболитно активна клетъчна популация. Тази популация може да представлява предполагаемата субпопулация от миелоидни супресорни клетки или плазмоцитоидни дендритни клетки, идентифицирани в scRNA-seq анализа. Въпреки че и двете са докладвани при човешки тумори на яйчниците [45], те все още се нуждаят от по-нататъшна работа, за да се опише тази миелоидна субпопулация.
Въпреки че методите, базирани на флоуцитометрия, могат да изяснят общите разлики в глюкозния и оксидативния метаболизъм между клетъчните типове, точните метаболити, произведени от глюкоза или други източници на въглерод за митохондриалния метаболизъм в TME, все още не са определени. Присвояването на наличието или отсъствието на метаболити към дадена TIL подгрупа изисква пречистване на клетъчната популация от изрязаната тъкан. Следователно, нашият метод за клетъчно обогатяване, комбиниран с масспектрометрия, може да предостави информация за метаболитите, които са диференциално обогатени в Т-клетките и популациите на туморни клетки в съответстващи проби от пациенти. Въпреки че този метод има предимства пред флуоресцентно-активираното клетъчно сортиране, някои метаболити в библиотеките могат да бъдат засегнати поради присъщата им стабилност и/или бързата скорост на оборот (22). Въпреки това, нашият метод успя да идентифицира два разпознати имуносупресивни метаболита, аденозин и кинуренин, тъй като те варират значително между различните видове проби.
Нашият метабономичен анализ на тумори и TIL подтипове предоставя повече информация за ролята на метаболитите в овариалния TME. Първо, използвайки флоуцитометрия, установихме, че няма разлика в митохондриалната активност между туморите и CD4+ Т-клетките. LC-MS/MS анализът обаче разкри значителни промени в изобилието на метаболити сред тези популации, което показва, че заключенията за TIL метаболизма и неговата цялостна метаболитна активност изискват внимателно тълкуване. Второ, MNA е метаболитът с най-голяма разлика между CD45-клетките и Т-клетките в асцит, а не в туморите. Следователно, компартментализацията и местоположението на тумора могат да имат различни ефекти върху TIL метаболизма, което подчертава възможната хетерогенност в дадена микросреда. Трето, експресията на MNA-продуциращия ензим NNMT е ограничена главно до CAF, който е туморен в по-малка степен, но откриваеми нива на MNA се наблюдават в туморно-производни Т-клетки. Свръхекспресията на NNMT в овариалния CAF има известен ракообразуващ ефект, отчасти поради насърчаването на CAF метаболизма, туморната инвазия и метастазите (27). Въпреки че общото ниво на TIL е умерено, експресията на NNMT в CAF е тясно свързана с мезенхимния подтип на Cancer Genome Atlas (TCGA), който е свързан с лоша прогноза (27, 46, 47). И накрая, експресията на ензима AOX1, отговорен за разграждането на MNA, също е ограничена до CAF популацията, което показва, че Т-клетките нямат способността да метаболизират MNA. Тези резултати подкрепят идеята, че въпреки че е необходима допълнителна работа за потвърждаване на това откритие, високите нива на MNA в Т-клетките могат да показват наличието на имуносупресивна CAF микросреда.
Като се има предвид ниското ниво на експресия на MNA транспортери и неоткриваемите нива на ключови протеини, участващи в метаболизма на MNA, наличието на MNA в Т-клетките е неочаквано. Нито NNMT, нито AOX1 могат да бъдат открити чрез scRNA-seq анализ и таргетна qPCR на две независими кохорти. Тези резултати показват, че MNA не се синтезира от Т-клетките, а се абсорбира от околния TME. In vitro експерименти показват, че Т-клетките са склонни да натрупват екзогенна MNA.
Нашите in vitro проучвания показват, че екзогенният MNA индуцира експресията на TNFα в Т-клетките и усилва свързването на Sp1 с TNFα промотора. Въпреки че TNFα има както противотуморни, така и противотуморни функции, при рак на яйчниците, TNFα може да стимулира растежа на рака на яйчниците (31-33). Неутрализирането на TNFα в култура от туморни клетки на яйчниците или елиминирането на TNFα сигнала в миши модели може да подобри производството на възпалителни цитокини, медиирано от TNFα, и да инхибира растежа на тумора (32, 35). Следователно, в този случай, MNA, получен от TME, може да действа като провъзпалителен метаболит чрез TNFα-зависим механизъм чрез автокринната верига, като по този начин насърчава появата и разпространението на рак на яйчниците (31). Въз основа на тази възможност, блокадата на TNFα се изучава като потенциално терапевтично средство за рак на яйчниците (37, 48, 49). Освен това, MNA нарушава цитотоксичността на CAR-T клетките към туморните клетки на яйчниците, предоставяйки допълнителни доказателства за MNA-медиирана имуносупресия. Взети заедно, тези резултати предполагат модел, при който тумори и CAF клетки секретират MNA в извънклетъчен TME. Чрез (i) индуцирана от TNF стимулация на растежа на рак на яйчниците и (ii) инхибиране на цитотоксичната активност на Т-клетките, индуцирана от MNA, това може да има двоен туморен ефект (Фигура 5D).
В заключение, чрез прилагане на комбинация от бързо клетъчно обогатяване, секвениране на единични клетки и метаболитно профилиране, това проучване разкри огромните имунометаболомични разлики между туморните и асцитните клетки при пациенти с HGSC. Този цялостен анализ показа, че има разлики в усвояването на глюкоза и митохондриалната активност между Т-клетките и идентифицира MNA като неклетъчен автономен имунорегулаторен метаболит. Тези данни оказват влияние върху това как TME влияе върху метаболизма на Т-клетките при човешки рак. Въпреки че е съобщена пряка конкуренция за хранителни вещества между Т-клетките и раковите клетки, метаболитите могат да действат и като индиректни регулатори, за да насърчат туморната прогресия и евентуално да потиснат ендогенните имунни отговори. По-нататъшното описание на функционалната роля на тези регулаторни метаболити може да отвори алтернативни стратегии за засилване на противотуморния имунен отговор.
Проби от пациенти и клинични данни са получени чрез хранилище за тъкани на ракови тумори на Британска Колумбия, сертифицирано от Канадската мрежа за тъканни хранилища. Съгласно протокола, одобрен от Комитета по етика на изследванията на рака на Британска Колумбия и Университета на Британска Колумбия (H07-00463), всички проби и клинични данни на пациентите са получили информирано писмено съгласие или официално са се отказали от съгласието си. Пробите се съхраняват в сертифицираната BioBank (BRC-00290). Подробни характеристики на пациентите са показани в таблици S1 и S5. За криоконсервация се използва скалпел за механично разлагане на туморната проба на пациента и след това тя се прекарва през 100-микронен филтър, за да се получи суспензия от единични клетки. Асцитът на пациента е центрофугиран при 1500 rpm за 10 минути при 4°C, за да се пелетизират клетките и да се отстрани супернатантата. Клетките, получени от тумора и асцита, са криоконсервирани в 50% топлинно инактивиран човешки AB серум (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) и 10% диметилсулфоксид. Тези консервирани суспензии от единични клетки бяха размразени и използвани за метаболомика и определяне на метаболити, описани по-долу.
Пълната среда се състои от 0,22 μm филтрирана 50:50 допълнена RPMI 1640:AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-глутамин (Thermo Fisher Scientific), допълнена с 10% инактивиран чрез топлина човешки AB серум (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-глутамин (Thermo Fisher Scientific), 1 x разтвор на пеницилин-стрептомицин (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) и 50 μMB-меркаптоетанол. AimV (Invitrogen) е допълнена с 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) и 2 mM l-глутамин (Thermo Fisher Scientific). Буферът за оцветяване на флоуцитометъра се състои от 0,22 μm филтриран фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS; Invitrogen), допълнен с 3% инактивиран чрез топлина AB човешки серум (Sigma). Буферът за обогатяване на клетките е съставен от 0,22 μm филтриран PBS и допълнен с 0,5% инактивиран чрез топлина човешки AB серум (Sigma-Aldrich).
В пълна хранителна среда при 37°C, клетките бяха оцветени с 10 nM MT DR и 100 μM 2-NBDG за 30 минути. След това клетките бяха оцветени с багрило за жизнеспособност eF506 при 4°C за 15 минути. Ресуспендирайте клетките в FC Block (eBioscience) и Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), разредете в буфер за оцветяване на флоуцитометрия (съгласно инструкциите на производителя) и инкубирайте за 10 минути на стайна температура. Оцветете клетките с набор от антитела (Таблица S2) в буфер за оцветяване на флоуцитометрия при 4°C за 20 минути. Ресуспендирайте клетките в буфер за оцветяване на флоуцитометрия (Cytek Aurora; конфигурация 3L-16V-14B-8R) преди анализа. Използвайте SpectroFlo и FlowJo V10 за анализ на данните за броя на клетките и използвайте GraphPad Prism 8 за създаване на данните. Медианният интензитет на флуоресценция (MFI) на 2-NBDG и MT DR беше логаритмично нормализиран, след което за статистически анализ беше използван сдвоен t-тест, за да се отчетат съответстващите пациенти. Премахнете от анализа всички популации с по-малко от 40 събития; въведете MFI стойност от 1 за всички отрицателни стойности, преди да извършите статистически анализ и визуализация на данните.
За да допълним стратегията за ръчно гейтиране на горния панел за обработка, използвахме пълната анотация от дървото за ограничаване на формата (FAUST) (21), за да присвоим автоматично клетките на популацията след елиминиране на мъртвите клетки във FlowJo. Ръчно управлявахме изхода, за да обединим популациите, които изглеждат неправилно разпределени (комбиниране на PD1+ с PD1-туморни клетки) и запазените популации. Всяка проба съдържа средно повече от 2% клетки, за общо 11 популации.
За отделяне на PBMC от продуктите от левкоцитното разделяне беше използвано центрофугиране с градиент на плътност с Ficoll (STEMCELL Technologies). CD8+ T клетки бяха изолирани от PBMC с помощта на CD8 MicroBeads (Miltenyi) и размножени в пълна среда с помощта на TransAct (Miltenyi) в продължение на 2 седмици, съгласно инструкциите на производителя. Клетките бяха оставени да престоят 5 дни в пълна среда, съдържаща IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), и след това бяха повторно стимулирани с TransAct. На 7-ия ден, съгласно инструкциите на производителя, човешки CD45 MicroBeads (Miltenyi) бяха използвани за обогатяване на клетките в три последователни кръга. Клетките бяха аликвотирани за анализ с флоуцитометрия (както е описано по-горе) и един милион клетки бяха аликвотирани три пъти за LC-MS/MS анализ. Пробите бяха обработени чрез LC-MS/MS, както е описано по-долу. Оценихме стойността на липсващия метаболит с йонно число 1000. Всяка проба се нормализира по общия йонен брой (TIC), логаритмично се преобразува и се нормализира автоматично в MetaboAnalystR преди анализа.
Суспензията от единични клетки на всеки пациент беше размразена и филтрирана през 40 μm филтър в пълна среда (както е описано по-горе). Съгласно протокола на производителя, три последователни кръга на положителна селекция чрез магнитно разделяне с микросфери, използващи MicroBeads (Miltenyi), бяха използвани за обогатяване на пробите за CD8+, CD4+ и CD45- клетки (върху лед). Накратко, клетките се ресуспендират в буфер за обогатяване на клетки (както е описано по-горе) и се преброяват. Клетките се инкубират с човешки CD8 перли, човешки CD4 перли или човешки CD45 перли (Miltenyi) при 4°C за 15 минути и след това се промиват с буфер за обогатяване на клетки. Пробата се прекарва през LS колоната (Miltenyi) и се събират положителните и отрицателните фракции. За да се намали продължителността и да се увеличи максимално етапът на възстановяване на клетките, CD8-фракцията се използва за втория кръг на обогатяване с CD4+, а CD4-фракцията се използва за последващото обогатяване с CD45. Разтворът се съхранява върху лед през целия процес на разделяне.
За да се подготвят пробите за метаболитен анализ, клетките бяха промити веднъж с леденостуден солен разтвор и към всяка проба беше добавен 1 ml 80% метанол, след което бяха разбъркани на вортекс и замразени бързо в течен азот. Пробите бяха подложени на три цикъла на замразяване-размразяване и центрофугирани при 14 000 rpm за 15 минути при 4°C. Супернатантът, съдържащ метаболитите, се изпарява до сухо състояние. Метаболитите бяха разтворени отново в 50 μl 0,03% мравчена киселина, разбъркани на вортекс, за да се смесят, и след това центрофугирани за отстраняване на остатъци.
Екстрахирайте метаболитите, както е описано по-горе. Прехвърлете супернатантата в бутилка за високоефективна течна хроматография за метаболомни изследвания. Използвайте протокол за произволно третиране, за да третирате всяка проба с подобен брой клетки, за да предотвратите ефектите на партидата. Извършихме качествена оценка на глобалните метаболити, публикувана по-рано на AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Хроматографският анализ и интегрирането на площта на пиковете бяха извършени с помощта на софтуера MultiQuant версия 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
За оценка на стойността на липсващия метаболит беше използван йонен брой 1000, а TIC на всяка проба беше използван за изчисляване на нормализираната площ на пика на всеки открит метаболит, за да се коригират промените, въведени от инструменталния анализ при обработката на пробата. След нормализиране на TIC, MetaboAnalystR(51) (параметър по подразбиране) се използва за логаритмично преобразуване и автоматично мащабиране на нормалната линия. Използвахме PCA с vegan R пакет, за да извършим изследователски анализ на разликите в метаболома между типовете проби, и използвахме анализ на частична излишък, за да анализираме пациентите. Използвахме метода на Ward, за да изградим дендрограма на топлинна карта, за да клъстерираме евклидовото разстояние между пробите. Използвахме limma (52) върху стандартизирано изобилие на метаболити, за да идентифицираме различно изобилните метаболити в целия клетъчен тип и микросреда. За да опростим обяснението, използваме параметъра за средна стойност на групата, за да определим модела, и разглеждаме типовете клетки в микросредата като всяка група (n = 6 групи); за теста за значимост извършихме три повторни измервания за всеки метаболит. За да избегнем фалшива репликация, пациентът беше включен като пречка в дизайна на limma. За да проверим разликите в метаболитите между различните пациенти, коригирахме лима модела, включвайки пациентите по фиксиран начин. Докладваме значимостта на предварително зададения контраст между клетъчния тип и микросредата на Padj <0,05 (корекция на Бенджамини-Хохберг).
След обогатяване с жизненост, използвайки комплекта за премахване на мъртви клетки Miltenyi (>80% жизнеспособност), беше извършено секвениране на транскриптоми на единични клетки върху общите живи замразени проби от асцит и тумор, използвайки протокол за експресия на 10x 5′ ген. Анализирани бяха пет случая със съответстващи тумори и асцит, въпреки че ниската жизнеспособност от една туморна проба предотврати включването ѝ. За да постигнем множество селекции на пациенти, комбинирахме пробите от всеки пациент в лентите на 10x хромовия контролер и анализирахме асцитните и туморните места поотделно. След секвениране [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; средно 73 488 и 41 378 прочитания на клетка съответно за тумор и асцит]], използвахме CellSNP и Vireo (53) (базирани на CellSNP като Общият човешки SNP (VCF), предоставен от GRCh38, е присвоен на донорска идентичност. Използваме SNPRelate, за да определим най-близката идентичност (IBS) на генотипния статус на пациента (IBS), като изключваме неопределени клетки и клетки, идентифицирани като дуплекси, и съответстващи донори между асцитни и туморни проби (54). Въз основа на тази задача запазихме три случая с изобилно клетъчно представяне в тумора и асцита за последващ анализ. След извършване на стъпка на масова филтрация в опаковката scater (55) и scran (56) BioConductor, това даде 6975 клетки (съответно 2792 и 4183 клетки от тумор и асцит) за анализ. Използваме igraph-овото (57) клъстериране на Louvain на споделена мрежа от най-близки съседи (SNN) въз основа на разстоянието на Jaccard до клъстерни клетки чрез експресия. Клъстерите бяха ръчно анотирани към предполагаемите клетъчни типове въз основа на експресията на маркерни гени и визуализирани с t-SNE. Цитотоксичните Т-клетки се определят от експресията на CD8A и GZMA, с изключение на подкластерите с ниска експресия на рибозомни протеини. Достъпихме до публикуваните данни на Izar et al. (16), включително тяхното вграждане на t-SNE, което може да контролира припокриването на експресията между маркерите на имунните клетки и експресията на NNMT.
PBMC бяха отделени от продуктите от левкоцитното разделяне (STEMCELL Technologies) чрез центрофугиране с градиент на плътност с Ficoll. CD3+ клетки бяха изолирани от PBMC, използвайки CD3 перли (Miltenyi). В присъствието или отсъствието на MNA, CD3+ клетките бяха активирани с CD3, свързан с плака (5μg/ml), разтворим CD28 (3μg/ml) и IL-2 (300 U/ml; Proleukin). В последния ден от експанзията, жизнеспособността (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) и пролиферацията (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) бяха оценени чрез флуоцитометрия. Оценете ефекторната функция чрез стимулиране на клетките с PMA (20 ng/ml) и йономицин (1μg/ml) с GolgiStop в продължение на 4 часа и наблюдавайте CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) и TNFα-флуоресцеин изотиоцианат (FITC) (MAb11, BD). Стимулирайте qPCR и ChIP клетки с PMA (20 ng/ml) и йономицин (1μg/ml) в продължение на 4 часа. ELISA супернатантът беше събран преди и след стимулация с PMA (20 ng/ml) и йономицин (1 μg/ml) в продължение на 4 часа.
Следвайте протокола на производителя за изолиране на РНК, използвайки RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Използвайте QIAshredder (QIAGEN) за хомогенизиране на пробата. Използвайте комплект за РНК към кДНК с висок капацитет (Thermo Fisher Scientific), за да синтезирате комплементарна ДНК (кДНК). Използвайте TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific), за да определите количествено генната експресия (съгласно протокола на производителя) със следните сонди: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [глицералдехид-3-фосфат от водород (GAPDH)] и Hs01010726_m1 (SLC22A2). Пробите бяха анализирани на системата за PCR в реално време StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) в MicroAmp бърза оптична 96-ямкова реакционна плака (Applied Biosystems) с MicroAmp оптичен филм. Всяка Ct стойност, която надвишава 35, се счита за над прага на откриване и се маркира като неоткриваема.
Извършете ChIP, както е описано по-рано (58). Накратко, клетките бяха третирани с формалдехид (крайна концентрация 1,42%) и инкубирани при стайна температура в продължение на 10 минути. Използвайте допълнен буфер за набъбване (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl и 0,1% NP-40) върху лед в продължение на 10 минути, след което ресуспендирайте в имунопреципитационен буфер, както е описано (58). След това пробата беше обработена с ултразвук със следните цикли: 10 цикъла (20 1-секундни импулса) и статично време от 40 секунди. Инкубирайте ChIP-клас имуноглобулин G (Cell Signaling Technology; 1μl), хистон H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) и SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) антитела с пробата при 4°CC и разклатете за една нощ. Инкубирайте протеинови А перли (Thermo Fisher Scientific) с пробата при 4°C с леко разклащане в продължение на 1 час, след което използвайте chelex перли (Bio-Rad) за обогатяване на ДНК и използвайте протеиназа К (Thermo Fisher) за смилане на протеина. TNFα промоторът беше открит чрез PCR: напред, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; напротив, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp продукт). Изображенията бяха получени от Image Lab (Bio-Rad) и количествено определени с помощта на софтуера ImageJ.
Супернатантът от клетъчната култура беше събран, както е описано по-горе. Определянето беше извършено съгласно процедурите на производителя за ELISA комплект за човешки TNFα (Invitrogen), ELISA комплект за човешки IL-2 (Invitrogen) и ELISA комплект за човешки IFN-γ (Abcam). Съгласно протокола на производителя, супернатантът беше разреден 1:100 за откриване на TNFα и IL-2 и 1:3 за откриване на IFN-γ. Използвайте EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) за измерване на абсорбцията при 450 nm.
PBMC бяха отделени от продуктите от левкоцитното разделяне (STEMCELL Technologies) чрез центрофугиране с градиент на плътност с Ficoll. CD3+ клетки бяха изолирани от PBMC, използвайки CD3 перли (Miltenyi). В присъствието или отсъствието на MNA, CD3+ клетките бяха активирани с CD3 (5μg/ml), разтворим CD28 (3μg/ml) и IL-2 (300 U/ml; Proleukin) в продължение на 3 дни. След 3 дни клетките бяха събрани и промити с 0.9% физиологичен разтвор, а утайката беше замразена бързо. Преброяването на клетките беше извършено чрез флуоцитометрия (Cytek Aurora; конфигурация 3L-16V-14B-8R), използвайки 123count eBeads.
Метаболитите се екстрахират, както е описано по-горе. Изсушеният екстракт е възстановен при концентрация от 4000 клетъчни еквивалента/μl. Пробата се анализира чрез обратно-фазова хроматография (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния) и колона CORTECS T3 (2,1×150 mm, размер на частиците 1,6 μm, размер на порите 120 Å; #186008500, Waters). Полярен масспектрометър (6470, Agilent), в който електроспрей йонизацията работи в положителен режим. Подвижна фаза А е 0,1% мравчена киселина (в H2O), подвижна фаза В е 90% ацетонитрил, 0,1% мравчена киселина. Градиентът на LC е от 0 до 2 минути за 100% A, от 2 до 7,1 минути за 99% B и от 7,1 до 8 минути за 99% B. След това колоната се уравновесява отново с мобилна фаза A при скорост на потока 0,6 ml/min за 3 минути. Скоростта на потока е 0,4 ml/min и камерата на колоната се нагрява до 50°C. Използвайте чистия химичен стандарт на MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada), за да установите времето на задържане (RT) и трансформацията (RT = 0,882 минути, трансформация 1 = 137→94,1, трансформация 2 = 137→92, конверсия 3 = 137→78). Когато и трите прехода се случат при правилното време на задържане, преход 1 се използва за количествено определяне, за да се гарантира специфичност. Стандартната крива на MNA (Toronto Research Chemical Company) е генерирана чрез шест серийни разреждания на основния разтвор (1 mg/ml), за да се получат стандарти от 0,1, 1,0, 10 и 100 ng/ml и 1,0 и 10μg/ml съответно течност. Границата на откриване е 1 ng/ml, а линейният отговор е между 10 ng/ml и 10μg/ml. Всяко инжектиране на два микролитра проба и стандарт се използва за LC/MS анализ, а смесена проба за контрол на качеството се провежда на всеки осем инжекции, за да се гарантира стабилността на платформата за анализ. MNA отговорите на всички третирани с MNA клетъчни проби са в линейния диапазон на анализа. Анализът на данните е извършен с помощта на софтуера за количествен анализ MassHunter (v9.0, Agilent).
Конструкцията αFR-CAR от второ поколение е взета от Song et al. (59). Накратко, конструкцията съдържа следното съдържание: лидерна последователност на CD8a, човешки αFR-специфичен едноверижен вариабилен фрагмент, шарнирна и трансмембранна област на CD8a, вътреклетъчен домен CD27 и вътреклетъчен домен CD3z. Пълната CAR последователност е синтезирана чрез GenScript и след това клонирана във вектора за експресия на лентивирус от второ поколение преди експресионната касета GFP, използвана за оценка на ефективността на трансдукцията.
Лентивирусът се произвежда чрез трансфекция на HEK293T клетки [Американска колекция от типови култури (ATCC); култивирани в модифицирана среда Eagle на Dulbecco, съдържаща 10% фетален говежди серум (FBS) и 1% PenStrep, и използван CAR-GFP вектор и Опаковъчните плазмиди (psPAX2 и pMD2.G, Addgene) използват липофекционен амин (Sigma-Aldrich). Супернатантът, съдържащ вируса, е събран 48 и 72 часа след трансфекцията, филтриран и концентриран чрез ултрацентрофугиране. Съхранявайте концентрирания вирусен супернатант при -80°C до трансдукцията.
PBMC се отделят от продуктите за сепариране на левкоцити от здрави донори (STEMCELL Technologies) чрез центрофугиране с градиентна плътност на Ficoll. Използвайте CD8 микросфери с положителна селекция (Miltenyi) за изолиране на CD8+ клетки от PBMC. Стимулирайте Т-клетките с TransAct (Miltenyi) и в среда TexMACS [Miltenyi; допълнена с 3% топлинно инактивиран човешки серум, 1% PenStrep и IL-2 (300 U/ml)]. Двадесет и четири часа след стимулацията, Т-клетките бяха трансдуцирани с лентивирус (10 μl концентриран вирусен супернатант на 106 клетки). 1 до 3 дни след трансдукцията върху Cytek Aurora (върху FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), оценете GFP експресията на клетките, за да демонстрирате ефективност на трансдукция от поне 30%.
CAR-T клетките бяха култивирани в продължение на 24 часа в Immunocult (STEMCELL Technologies; допълнена с 1% PenStrep) при следните условия: нетретирани, третирани с 250 μM аденозин или 10 mM MNA. След предварителна обработка, CAR-T клетките бяха промити с PBS и комбинирани с 20 000 SK-OV-3 клетки [ATCC; в среда McCoy 5A (Sigma-Aldrich), допълнена с 10% FBS и 1% PenStrep при 10: Съотношението ефектор към мишена от 1 беше амплифицирано трикратно в допълнена Immunocult среда. SK-OV-3 клетки и SK-OV-3 клетки, лизирани с дигиталисов сапонин (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich), бяха използвани съответно като отрицателни и положителни контроли. След 24 часа съвместно култивиране, супернатантата беше събрана и лактатдехидрогеназата (LDH) беше измерена съгласно инструкциите на производителя (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Супернатантът на LDH беше разреден 1:50 в LDH буфер. Процентът на убиване беше измерен по следната формула: процент на убиване = процент на корекция / максимална степен на убиване x 100%, където процент на корекция = само ко-култура-Т клетки, а максимална степен на убиване = положителна контрола-отрицателна контрола.
Както е описано в текста или материалите и методите, използвайте GraphPad Prism 8, Microsoft Excel или R v3.6.0 за статистически анализ. Ако от един и същ пациент са събрани множество проби (като асцит и тумор), използваме сдвоен t-тест или включваме пациента като случаен ефект в линеен или обобщен модел, според случая. За метаболомен анализ тестът за важност се извършва в три екземпляра.
За допълнителни материали към тази статия, моля вижте http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Това е статия с отворен достъп, разпространявана съгласно условията на Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, който позволява използването, разпространението и възпроизвеждането във всякакъв носител, стига крайната употреба да не е за търговска печалба и предпоставката е, че оригиналното произведение е коректно. Справка.
Забележка: Молим ви да предоставите имейл адреса си само за да знае човекът, когото препоръчвате на страницата, че искате да види имейла и че не е спам. Няма да събираме никакви имейл адреси.
Този въпрос се използва, за да се провери дали сте посетител и да се предотврати автоматичното изпращане на спам.
Мариса К. Килгор (Мариса К. Килгор), Сара Макферсън (Сара Макферсън), Лорън Г. Захариас (Лорън Г. Захариас), Абигейл Ели Арис Г. Уотсън (Х. Уотсън), Джон Стаг (Джон Стаг), Брад Х. Нелсън (Брад Х. Нелсън), Ралф Дж. Де Белардини (Ралф Дж. Де Берардинис), Ръсел Г. Джоунс (Russell G. Jones), Финиъс Т. Хамилтън (Финес Т.
MNA допринася за имуносупресията на Т-клетките и представлява потенциална имунотерапевтична цел за лечение на рак при хора.
Мариса К. Килгор (Мариса К. Килгор), Сара Макферсън (Сара Макферсън), Лорън Г. Захариас (Лорън Г. Захариас), Абигейл Ели Арис Г. Уотсън (Х. Уотсън), Джон Стаг (Джон Стаг), Брад Х. Нелсън (Брад Х. Нелсън), Ралф Дж. Де Белардини (Ралф Дж. Де Берардинис), Ръсел Г. Джоунс (Russell G. Jones), Финиъс Т. Хамилтън (Финес Т.
MNA допринася за имуносупресията на Т-клетките и представлява потенциална имунотерапевтична цел за лечение на рак при хора.
©2021 Американска асоциация за напредък на науката. всички права запазени. AAAS е партньор на HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.