Пропионовата киселина (PPA), противогъбично средство и често срещана хранителна добавка, е доказано, че причинява анормално невроразвитие при мишки, придружено от стомашно-чревна дисфункция, която може да бъде причинена от чревна дисбиоза. Предполага се връзка между експозицията на PPA в храната и дисбиозата на чревната микробиота, но тя не е била пряко изследвана. Тук изследвахме свързаните с PPA промени в състава на чревната микробиота, които могат да доведат до дисбиоза. Чревните микробиоми на мишки, хранени с нетретирана диета (n=9) и диета, обогатена с PPA (n=13), бяха секвенирани с помощта на метагеномно секвениране с дълги разстояния, за да се оценят разликите в микробния състав и бактериалните метаболитни пътища. PPA в храната беше свързана с увеличаване на изобилието от значими таксони, включително няколко вида Bacteroides, Prevotella и Ruminococcus, членове на които преди това са били замесени в производството на PPA. Микробиомите на мишки, изложени на PPA, също имаха повече пътища, свързани с липидния метаболизъм и биосинтеза на стероидни хормони. Нашите резултати показват, че PPA може да промени чревната микробиота и свързаните с нея метаболитни пътища. Тези наблюдавани промени подчертават, че консервантите, класифицирани като безопасни за консумация, могат да повлияят на състава на чревната микробиота и от своя страна на човешкото здраве. Сред тях, P, G или S се избира в зависимост от анализираното ниво на класификация. За да се сведе до минимум въздействието на фалшиво положителните класификации, е приет минимален праг на относително изобилие от 1e-4 (1/10 000 отчитания). Преди статистическия анализ, относителното изобилие, докладвано от Bracken (fraction_total_reads), е трансформирано с помощта на центрираната логаритмична трансформация (CLR) (Aitchison, 1982). CLR методът е избран за трансформация на данните, защото е мащабно-инвариантен и достатъчен за неразредени набори от данни (Gloor et al., 2017). CLR трансформацията използва естествен логаритъм. Данните за преброяването, докладвани от Bracken, са нормализирани с помощта на относителния логаритмичен израз (RLE) (Anders and Huber, 2010). Фигурите са генерирани с помощта на комбинация от matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 и последователни логаритми (Gloor et al., 2017). 0.12.2 и стантанотации v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Съотношението Bacillus/Bacteroidetes е изчислено за всяка проба, използвайки нормализиран брой бактерии. Стойностите, представени в таблиците, са закръглени до 4 знака след десетичната запетая. Индексът на разнообразие на Симпсън е изчислен с помощта на скрипта alpha_diversity.py, предоставен в пакета KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). Докладът на Bracken е предоставен в скрипта, а индексът на Симпсън „Si“ е предоставен за параметъра -an. Значимите разлики в числеността са определени като средни разлики в CLR ≥ 1 или ≤ -1. Средна разлика в CLR от ±1 показва 2,7-кратно увеличение на числеността на даден тип проба. Знакът (+/-) показва дали таксонът е по-изобилен съответно в пробата PPA и контролната проба. Значимостта е определена с помощта на U-теста на Ман-Уитни (Virtanen et al., 2020). Използван е Statsmodels v. 0.14 (Benjamini and Hochberg, 1995; Seabold and Perktold, 2010), а за коригиране на множественото тестване е приложена процедурата на Бенджамини-Хохберг. Като праг за определяне на статистическата значимост е използвана коригирана p-стойност ≤ 0,05.
Човешкият микробиом често е наричан „последният орган на тялото“ и играе жизненоважна роля за човешкото здраве (Baquero and Nombela, 2012). По-специално, чревният микробиом е признат за своето системно влияние и роля в много основни функции. Коменсалните бактерии са в изобилие в червата, заемайки множество екологични ниши, използвайки хранителни вещества и конкурирайки се с потенциални патогени (Jandhyala et al., 2015). Разнообразните бактериални компоненти на чревната микробиота са способни да произвеждат основни хранителни вещества като витамини и да насърчават храносмилането (Rowland et al., 2018). Доказано е също, че бактериалните метаболити влияят върху развитието на тъканите и подобряват метаболитните и имунните пътища (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Съставът на човешкия чревен микробиом е изключително разнообразен и зависи от генетични и екологични фактори като диета, пол, лекарства и здравословно състояние (Kumbhare et al., 2019).
Майчината диета е критичен компонент на феталното и неонаталното развитие и предполагаем източник на съединения, които могат да повлияят на развитието (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Едно такова интересно съединение е пропионовата киселина (PPA), страничен продукт от късоверижна мастна киселина, получен от бактериална ферментация, и хранителна добавка (den Besten et al., 2013). PPA има антибактериални и противогъбични свойства и следователно се използва като консервант за храни и в промишлени приложения за инхибиране на растежа на мухъл и бактерии (Wemmenhove et al., 2016). PPA има различни ефекти в различните тъкани. В черния дроб PPA има противовъзпалителни ефекти, като повлиява експресията на цитокини в макрофагите (Kawasoe et al., 2022). Този регулаторен ефект е наблюдаван и в други имунни клетки, което води до понижаване на възпалението (Haase et al., 2021). Обаче, обратният ефект е наблюдаван в мозъка. Предишни проучвания показват, че излагането на PPA предизвиква аутистично поведение при мишки (El-Ansary et al., 2012). Други проучвания показват, че PPA може да индуцира глиоза и да активира провъзпалителни пътища в мозъка (Abdelli et al., 2019). Тъй като PPA е слаба киселина, тя може да дифундира през чревния епител в кръвния поток и по този начин да пресече рестриктивни бариери, включително кръвно-мозъчната бариера, както и плацентата (Stinson et al., 2019), което подчертава значението на PPA като регулаторен метаболит, произвеждан от бактерии. Въпреки че потенциалната роля на PPA като рисков фактор за аутизъм в момента се изследва, нейните ефекти върху хора с аутизъм могат да се простират отвъд индуцирането на неврална диференциация.
Стомашно-чревни симптоми като диария и запек са често срещани при пациенти с неврологични разстройства (Cao et al., 2021). Предишни проучвания показват, че микробиомът на пациенти с разстройства от аутистичния спектър (РАС) се различава от този на здрави индивиди, което предполага наличие на дисбиоза на чревната микробиота (Finegold et al., 2010). По подобен начин, характеристиките на микробиома на пациенти с възпалителни заболявания на червата, затлъстяване, болест на Алцхаймер и др. също се различават от тези на здрави индивиди (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Досега обаче не е установена причинно-следствена връзка между чревния микробиом и неврологичните заболявания или симптоми (Yap et al., 2021), въпреки че се смята, че няколко бактериални вида играят роля в някои от тези болестни състояния. Например, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio и други родове са по-изобилни в микробиотата на пациенти с аутизъм (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Забележително е, че видовете, принадлежащи към някои от тези родове, притежават гени, свързани с производството на PPA (Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023). Като се имат предвид антимикробните свойства на PPA, увеличаването на нейното количество може да бъде полезно за растежа на бактерии, произвеждащи PPA (Jacobson et al., 2018). По този начин, богата на PFA среда може да доведе до промени в чревната микробиота, включително стомашно-чревни патогени, които могат да бъдат потенциални фактори, водещи до стомашно-чревни симптоми.
Централен въпрос в изследванията на микробиома е дали разликите в микробния състав са причина или симптом на основни заболявания. Първата стъпка към изясняване на сложната връзка между диетата, чревния микробиом и неврологичните заболявания е да се оцени влиянието на диетата върху микробния състав. За тази цел използвахме метагеномно секвениране с дълги четения, за да сравним чревните микробиоми на потомство на мишки, хранени с диета, богата или бедна на PPA. Потомството е било хранено със същата диета като майките си. Предположихме, че диета, богата на PPA, ще доведе до промени в чревния микробен състав и микробните функционални пътища, особено тези, свързани с метаболизма на PPA и/или производството на PPA.
В това проучване са използвани трансгенни мишки FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories), които свръхекспресират зелен флуоресцентен протеин (GFP) под контрола на глия-специфичния GFAP промотор, следвайки насоките на Комитета за грижа и използване на животните към Университета на Централна Флорида (UCF-IACUC) (номер на разрешение за употреба на животни: PROTO202000002). След отбиване, мишките са настанени поотделно в клетки с 1–5 мишки от всеки пол на клетка. Мишките са хранени ad libitum или с пречистена контролна диета (модифицирана отворена стандартна диета, 16 kcal% мазнини), или с диета, допълнена с натриев пропионат (модифицирана отворена стандартна диета, 16 kcal% мазнини, съдържаща 5000 ppm натриев пропионат). Количеството използван натриев пропионат е еквивалентно на 5000 mg PFA/kg общо тегло на храната. Това е най-високата концентрация на PPA, одобрена за употреба като консервант за храни. За да се подготвят за това проучване, родителските мишки са били хранени и с двете диети в продължение на 4 седмици преди чифтосване и това е продължило през цялата бременност на майката. Потомството на мишки [22 мишки, 9 контролни (6 мъжки, 3 женски) и 13 PPA (4 мъжки, 9 женски)] е било отбито и след това е продължило на същата диета като майките в продължение на 5 месеца. Потомството на мишки е било умъртвено на 5-месечна възраст и чревното им фекално съдържимо е било събрано и първоначално съхранявано в 1,5 ml микроцентрифужни епруветки при -20°C, след което е прехвърлено във фризер при -80°C, докато ДНК на гостоприемника се изчерпи и микробните нуклеинови киселини се екстрахират.
ДНК на гостоприемника беше отстранена съгласно модифициран протокол (Charalampous et al., 2019). Накратко, фекално съдържимо беше прехвърлено в 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) и съхранено замразено. Обработвайте максимум 1-2 фекални пелети на екстракция. След това фекалното съдържимо беше механично хомогенизирано с помощта на пластмасов пестик вътре в епруветката, за да се образува суспензия. Центрофугирайте пробите при 10 000 RCF за 5 минути или докато пробите се пелетизират, след което аспирирайте супернатантата и ресуспендирайте пелетата в 250 µl 1× PBS. Добавете 250 µl 4,4% разтвор на сапонин (TCI, продуктов номер S0019) към пробата като детергент за разхлабване на еукариотните клетъчни мембрани. Пробите бяха разбъркани внимателно до гладкост и инкубирани при стайна температура за 10 минути. След това, за да се разрушат еукариотните клетки, към пробата бяха добавени 350 μl вода без нуклеази, инкубирана в продължение на 30 секунди, след което бяха добавени 12 μl 5 M NaCl. След това пробите бяха центрофугирани при 6000 RCF в продължение на 5 минути. Аспирирайте супернатантата и ресуспендирайте утайката в 100 μl 1X PBS. За да отстраните ДНК на гостоприемника, добавете 100 μl HL-SAN буфер (12.8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml вода без нуклеази) и 10 μl ензим HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Пробите бяха смесени старателно чрез пипетиране и инкубирани при 37°C в продължение на 30 минути при 800 rpm на Eppendorf™ ThermoMixer C. След инкубация, центрофугирани при 6000 RCF в продължение на 3 минути и промити два пъти с 800 µl и 1000 µl 1X PBS. Накрая, утайката беше ресуспендирана в 100 µl 1X PBS.
Тоталната бактериална ДНК беше изолирана с помощта на комплекта за пречистване на геномна ДНК Monarch на New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). Стандартната оперативна процедура, предоставена с комплекта, е леко модифицирана. Инкубирайте и поддържайте вода без нуклеази при 60°C преди операцията за окончателно елуиране. Добавете 10 µl протеиназа К и 3 µl РНКаза А към всяка проба. След това добавете 100 µl клетъчен лизисен буфер и разбъркайте внимателно. След това пробите бяха инкубирани в Eppendorf™ ThermoMixer C при 56°C и 1400 rpm за поне 1 час и до 3 часа. Инкубираните проби бяха центрофугирани при 12 000 RCF за 3 минути и супернатантата от всяка проба беше прехвърлена в отделна 1,5 mL микроцентрифужна епруветка, съдържаща 400 µL свързващ разтвор. След това епруветките бяха импулсно вортексирани за 5–10 секунди на интервали от 1 секунда. Прехвърлете цялото течно съдържание на всяка проба (приблизително 600–700 µL) във филтърен патрон, поставен в епруветка за събиране на проточен материал. Епруветките бяха центрофугирани при 1000 RCF за 3 минути, за да се позволи първоначално свързване с ДНК, и след това центрофугирани при 12 000 RCF за 1 минута, за да се отстрани остатъчната течност. Колоната с пробата беше прехвърлена в нова епруветка за събиране и след това промита два пъти. За първото промиване добавете 500 µL промивен буфер към всяка епруветка. Обърнете епруветката 3–5 пъти и след това центрофугирайте при 12 000 RCF за 1 минута. Изхвърлете течността от епруветката за събиране и поставете филтърния патрон обратно в същата епруветка за събиране. За второто промиване добавете 500 µL промивен буфер към филтъра без обръщане. Пробите бяха центрофугирани при 12 000 RCF за 1 минута. Прехвърлете филтъра в 1,5 mL LoBind® епруветка и добавете 100 µL предварително загрята вода без нуклеази. Филтрите се инкубират при стайна температура за 1 минута и след това се центрофугират при 12 000 RCF за 1 минута. Елуираната ДНК се съхранява при -80°C.
Концентрацията на ДНК беше количествено определена с помощта на флуорометър Qubit™ 4.0. ДНК беше приготвена с помощта на Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (кат. № Q33231) съгласно инструкциите на производителя. Разпределението на дължината на ДНК фрагментите беше измерено с помощта на Aglient™ 4150 или 4200 TapeStation. ДНК беше приготвена с помощта на Agilent™ Genomic DNA Reagents (кат. № 5067-5366) и Genomic DNA ScreenTape (кат. № 5067-5365). Подготовката на библиотеката беше извършена с помощта на Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) съгласно инструкциите на производителя. ДНК беше секвенирана с помощта на секвенатор ONT GridION™ Mk1 с Min106D проточна клетка (R 9.4.1). Настройките за секвениране бяха: високоточно определяне на базата, минимална q стойност от 9, настройка на баркода и подрязване на баркода. Пробите бяха секвенирани в продължение на 72 часа, след което данните от базовите извиквания бяха изпратени за по-нататъшна обработка и анализ.
Биоинформатичната обработка беше извършена с помощта на предварително описани методи (Greenman et al., 2024). FASTQ файловете, получени от секвенирането, бяха разделени в директории за всяка проба. Преди биоинформатичния анализ данните бяха обработени с помощта на следния конвейер: първо, FASTQ файловете на пробите бяха обединени в един FASTQ файл. След това, четения, по-къси от 1000 bp, бяха филтрирани с помощта на Filtlong v. 0.2.1, като единственият променен параметър беше –min_length 1000 (Wick, 2024). Преди по-нататъшно филтриране, качеството на четене беше контролирано с помощта на NanoPlot v. 1.41.3 със следните параметри: –fastq –plots dot –N50 -o
За таксономична класификация, прочетените данни и сглобените контиги бяха класифицирани с помощта на Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Генерирайте отчети и изходни файлове съответно за прочетени данни и сглобени данни. Използвайте опцията –use-names за анализ на прочетени данни и сглобени данни. Опциите –gzip-compressed и –paired са зададени за сегменти за прочетени данни. Относителното изобилие на таксони в метагеномите беше оценено с помощта на Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Първо създадохме kmer база данни, съдържаща 1000 бази, използвайки bracken-build със следните параметри: -d
Анотацията на гените и оценката на относителното изобилие бяха извършени с помощта на модифицирана версия на протокола, описан от Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Първо, контиги, по-къси от 500 bp, бяха премахнати от всички асемблита, използвайки SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Избраните асемблита бяха комбинирани в пан-метагеном. Отворените рамки за четене (ORF) бяха идентифицирани с помощта на Prodigal v. 1.0.1 (паралелна версия на Prodigal v. 2.6.3) със следните параметри: -d
Гените първо бяха групирани според ортологичните (KO) идентификатори от Киотската енциклопедия на гените и геномите (KEGG), присвоени от eggNOG, за да се сравни изобилието на генните пътища. Гените без нокаути или гените с множество нокаути бяха премахнати преди анализа. След това беше изчислена средната изобилие на всеки KO на проба и беше извършен статистически анализ. Гените за метаболизъм на PPA бяха дефинирани като всеки ген, на който е присвоен ред ko00640 в колоната KEGG_Pathway, което показва роля в метаболизма на пропионат според KEGG. Гените, идентифицирани като свързани с производството на PPA, са изброени в Допълнителна таблица 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Бяха проведени пермутационни тестове, за да се идентифицират гени за метаболизъм и производство на PPA, които бяха значително по-изобилни във всеки тип проба. За всеки анализиран ген бяха извършени хиляда пермутации. P-стойност от 0,05 беше използвана като гранична стойност за определяне на статистическата значимост. Функционални анотации бяха присвоени на отделните гени в клъстера въз основа на анотациите на представителните гени в клъстера. Таксони, свързани с метаболизма на PPA и/или производството на PPA, могат да бъдат идентифицирани чрез съпоставяне на идентификаторите на контиги в изходните файлове на Kraken2 със същите идентификатори на контиги, запазени по време на функционалната анотация, използвайки eggNOG. Тестването за значимост беше извършено с помощта на U теста на Ман-Уитни, описан по-рано. Корекцията за множествено тестване беше извършена с помощта на процедурата на Бенджамини-Хохберг. p-стойност ≤ 0,05 беше използвана като гранична стойност за определяне на статистическата значимост.
Разнообразието на чревния микробиом на мишките беше оценено с помощта на индекса на разнообразие на Симпсън. Не бяха наблюдавани значителни разлики между контролните и PPA пробите по отношение на родовото и видовото разнообразие (p-стойност за рода: 0,18, p-стойност за вида: 0,16) (Фигура 1). След това микробният състав беше сравнен с помощта на анализ на главните компоненти (PCA). Фигура 2 показва групирането на пробите по техния тип, което показва, че има разлики във видовия състав на микробиомите между PPA и контролните проби. Това групиране беше по-слабо изразено на ниво род, което предполага, че PPA засяга определени бактерии (Допълнителна фигура 1).
Фигура 1. Алфа разнообразие на родове и видов състав на чревния микробиом на мишката. Диаграми тип „кутия“, показващи индексите на разнообразие на Симпсън на родове (A) и видове (B) в PPA и контролни проби. Значимостта е определена с помощта на U теста на Ман-Уитни, а множествената корекция е извършена с помощта на процедурата на Бенджамини-Хохберг. ns, p-стойността не е значима (p>0,05).
Фигура 2. Резултати от анализа на главните компоненти на състава на чревния микробиом на мишки на видово ниво. Графиката на анализа на главните компоненти показва разпределението на пробите по първите им два главни компонента. Цветовете показват вида на пробата: мишки, изложени на PPA, са лилави, а контролните мишки са жълти. Главни компоненти 1 и 2 са нанесени съответно на оста x и оста y и са изразени като обяснено съотношение на дисперсията.
Използвайки данни от трансформирано броене, получени чрез RLE, е наблюдавано значително намаление на средното съотношение Bacteroidetes/Bacilli при контролните и PPA мишки (контролна група: 9,66, PPA: 3,02; p-стойност = 0,0011). Тази разлика се дължи на по-голямото изобилие на Bacteroidetes при PPA мишки в сравнение с контролните, въпреки че разликата не е значима (средна CLR за контролната група: 5,51, средна CLR за PPA: 6,62; p-стойност = 0,054), докато изобилието на Bacteroidetes е сходно (средна CLR за контролната група: 7,76, средна CLR за PPA: 7,60; p-стойност = 0,18).
Анализът на числеността на таксономичните членове на чревния микробиом разкри, че 1 тип и 77 вида се различават значително между PPA и контролните проби (Допълнителна таблица 2). Числеността на 59 вида в PPA пробите е значително по-висока от тази в контролните проби, докато числеността само на 16 вида в контролните проби е по-висока от тази в PPA пробите (Фигура 3).
Фигура 3. Различно изобилие на таксони в чревния микробиом на PPA и контролни мишки. Вулканичните диаграми показват разлики в изобилието на родове (A) или видове (B) между PPA и контролните проби. Сивите точки показват, че няма значителна разлика в изобилието на таксони. Цветните точки показват значителни разлики в изобилието (p-стойност ≤ 0,05). Топ 20 таксона с най-големи разлики в изобилието между типовете проби са показани съответно в червено и светлосиньо (контролни и PPA проби). Жълтите и лилавите точки са поне 2,7 пъти по-изобилни в контролните или PPA проби, отколкото в контролните. Черните точки представляват таксони със значително различно изобилие, със средни CLR разлики между -1 и 1. P стойностите са изчислени с помощта на U теста на Ман-Уитни и коригирани за многократно тестване с помощта на процедурата на Бенджамини-Хохберг. Удебелените средни CLR разлики показват значителни разлики в изобилието.
След анализ на чревния микробен състав, извършихме функционална анотация на микробиома. След филтриране на гени с ниско качество, общо 378 355 уникални гена бяха идентифицирани във всички проби. Трансформираното изобилие на тези гени беше използвано за анализ на главните компоненти (PCA) и резултатите показаха висока степен на клъстериране на типовете проби въз основа на техните функционални профили (Фигура 4).
Фигура 4. Резултати от PCA, използващи функционалния профил на чревния микробиом на мишка. PCA графиката показва разпределението на пробите по първите им два основни компонента. Цветовете показват вида на пробата: мишки, изложени на PPA, са лилави, а контролни мишки са жълти. Главни компоненти 1 и 2 са нанесени съответно на оста x и оста y и са изразени като обяснено съотношение на дисперсията.
След това изследвахме изобилието на KEGG нокаути в различни типове проби. Идентифицирани бяха общо 3648 уникални нокаута, от които 196 бяха значително по-изобилни в контролните проби и 106 бяха по-изобилни в PPA проби (Фигура 5). Общо 145 гена бяха открити в контролните проби и 61 гена в PPA проби, със значително различно изобилие. Пътища, свързани с метаболизма на липидите и аминозахарите, бяха значително по-богати в PPA проби (Допълнителна таблица 3). Пътища, свързани с азотния метаболизъм и серните релейни системи, бяха значително по-богати в контролните проби (Допълнителна таблица 3). Изобилието на гени, свързани с метаболизма на аминозахарите/нуклеотидите (ko:K21279) и метаболизма на инозитол фосфата (ko:K07291), беше значително по-високо в PPA проби (Фигура 5). Контролните проби имаха значително повече гени, свързани с метаболизма на бензоата (ko:K22270), азотния метаболизъм (ko:K00368) и гликолизата/глюконеогенезата (ko:K00131) (Фигура 5).
Фиг. 5. Различно изобилие на KOs (окислителни остатъци) в чревния микробиом на PPA и контролни мишки. Вулканичната диаграма изобразява разликите в изобилието на функционални групи (KOs). Сивите точки показват KOs, чието изобилие не се различава значително между типовете проби (p-стойност > 0,05). Цветните точки показват значителни разлики в изобилието (p-стойност ≤ 0,05). 20-те KOs с най-големи разлики в изобилието между типовете проби са показани в червено и светлосиньо, съответстващи съответно на контролните и PPA проби. Жълтите и лилавите точки показват KOs, които са били поне 2,7 пъти по-изобилни съответно в контролните и PPA проби. Черните точки показват KOs със значително различно изобилие, със средни CLR разлики между -1 и 1. P стойностите са изчислени с помощта на U теста на Ман-Уитни и коригирани за множество сравнения, използвайки процедурата на Бенджамини-Хохберг. NaN показва, че KO не принадлежи към път в KEGG. Удебелените средни CLR разлики показват значителни разлики в изобилието. За подробна информация относно пътищата, към които принадлежат изброените KO, вижте Допълнителна таблица 3.
Сред анотираните гени, 1601 гена са имали значително различно изобилие между типовете проби (p ≤ 0,05), като всеки ген е бил поне 2,7 пъти по-изобилен. От тези гени, 4 гена са били по-изобилни в контролните проби, а 1597 гена са били по-изобилни в PPA проби. Тъй като PPA има антимикробни свойства, ние изследвахме изобилието на гени за метаболизъм и производство на PPA между типовете проби. Сред 1332 гена, свързани с метаболизма на PPA, 27 гена са били значително по-изобилни в контролните проби, а 12 гена са били по-изобилни в PPA проби. Сред 223 гена, свързани с производството на PPA, 1 ген е бил значително по-изобилен в PPA проби. Фигура 6А допълнително показва по-голямото изобилие на гени, участващи в метаболизма на PPA, със значително по-високо изобилие в контролните проби и големи размери на ефекта, докато Фигура 6B подчертава отделни гени със значително по-високо изобилие, наблюдавано в PPA проби.
Фиг. 6. Различно изобилие на гени, свързани с PPA, в чревния микробиом на мишка. Вулканичните диаграми изобразяват разликите в изобилието на гени, свързани с метаболизма на PPA (A) и производството на PPA (B). Сивите точки показват гени, чието изобилие не се различава значително между типовете проби (p-стойност > 0,05). Цветните точки показват значителни разлики в изобилието (p-стойност ≤ 0,05). 20-те гена с най-големи разлики в изобилието са показани съответно в червено и светлосиньо (контролни и PPA проби). Изобилието на жълти и лилави точки е поне 2,7 пъти по-голямо в контролните и PPA проби, отколкото в контролните проби. Черните точки представляват гени със значително различно изобилие, със средни CLR разлики между -1 и 1. P стойностите са изчислени с помощта на U теста на Ман-Уитни и коригирани за множествени сравнения, използвайки процедурата на Бенджамини-Хохберг. Гените съответстват на представителни гени в каталога на нередундантните гени. Имената на гените се състоят от символа KEGG, обозначаващ KO ген. Удебелените средни CLR разлики показват значително различно изобилие. Тире (-) показва, че няма символ за гена в базата данни на KEGG.
Таксони с гени, свързани с метаболизма и/или производството на PPA, бяха идентифицирани чрез съпоставяне на таксономичната идентичност на контигите с контигния ID на гена. На ниво род бяха открити 130 рода с гени, свързани с метаболизма на PPA, и 61 рода с гени, свързани с производството на PPA (Допълнителна таблица 4). Въпреки това, нито един род не показа значителни разлики в изобилието (p > 0,05).
На видово ниво са открити 144 бактериални вида с гени, свързани с метаболизма на PPA, а 68 бактериални вида с гени, свързани с производството на PPA (Допълнителна таблица 5). Сред метаболизаторите на PPA, осем бактерии показват значително увеличение на изобилието между типовете проби и всички показват значителни промени в ефекта (Допълнителна таблица 6). Всички идентифицирани метаболизатори на PPA със значителни разлики в изобилието са по-изобилни в PPA пробите. Класификацията на видово ниво разкрива представители на родове, които не се различават съществено между типовете проби, включително няколко вида Bacteroides и Ruminococcus, както и Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus и Alcaligenes polymorpha. Сред бактериите, произвеждащи PPA, четири бактерии показват значителни разлики в изобилието между типовете проби. Видовете със значителни разлики в изобилието включват Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis и Ruminococcus bovis.
В това проучване изследвахме ефектите от излагането на PPA върху чревната микробиота на мишки. PPA може да предизвика различни реакции у бактериите, тъй като се произвежда от определени видове, използва се като източник на храна от други видове или има антимикробни ефекти. Следователно, добавянето му към чревната среда чрез хранителни добавки може да има различни ефекти в зависимост от толерантността, чувствителността и способността да се използва като източник на хранителни вещества. Чувствителните бактериални видове могат да бъдат елиминирани и заменени от такива, които са по-устойчиви на PPA или са способни да я използват като източник на храна, което води до промени в състава на чревната микробиота. Нашите резултати разкриха значителни разлики в микробния състав, но без ефект върху цялостното микробно разнообразие. Най-големите ефекти бяха наблюдавани на видово ниво, като над 70 таксона се различават значително по изобилие между PPA и контролните проби (Допълнителна таблица 2). По-нататъшната оценка на състава на пробите, изложени на PPA, разкри по-голяма хетерогенност на микробните видове в сравнение с неекспонираните проби, което предполага, че PPA може да подобри характеристиките на растеж на бактериите и да ограничи бактериалните популации, които могат да оцелеят в богата на PPA среда. По този начин, PPA може селективно да индуцира промени, а не да причинява широко разпространено нарушаване на разнообразието на чревната микробиота.
Преди това е било доказано, че хранителните консерванти, като PPA, променят изобилието на компоненти на чревния микробиом, без да повлияват цялостното разнообразие (Nagpal et al., 2021). Тук наблюдавахме най-поразителните разлики между видовете Bacteroidetes в рамките на тип Bacteroidetes (известен преди като Bacteroidetes), които бяха значително обогатени при мишки, изложени на PPA. Повишеното изобилие от видове Bacteroides е свързано с повишено разграждане на слуз, което може да увеличи риска от инфекция и да насърчи възпалението (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Едно проучване установи, че новородени мъжки мишки, третирани с Bacteroides fragilis, проявяват социално поведение, напомнящо за разстройство от аутистичния спектър (ASD) (Carmel et al., 2023), а други проучвания показват, че видовете Bacteroides могат да променят имунната активност и да доведат до автоимунна възпалителна кардиомиопатия (Gil-Cruz et al., 2019). Видове, принадлежащи към родовете Ruminococcus, Prevotella и Parabacteroides, също бяха значително повишени при мишки, изложени на PPA (Coretti et al., 2018). Някои видове Ruminococcus са свързани със заболявания като болестта на Crohn чрез производството на провъзпалителни цитокини (Henke et al., 2019), докато видове Prevotella, като Prevotella humani, са свързани с метаболитни заболявания като хипертония и инсулинова чувствителност (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Накрая, установихме, че съотношението на Bacteroidetes (известни преди като Firmicutes) към Bacteroidetes е значително по-ниско при мишки, изложени на PPA, отколкото при контролни мишки, поради по-високото общо изобилие на видове Bacteroidetes. Това съотношение е било доказано преди това като важен индикатор за чревна хомеостаза, а нарушенията в това съотношение са свързани с различни болестни състояния (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), включително възпалителни заболявания на червата (Stojanov et al., 2020). Като цяло, видовете от тип Bacteroidetes изглежда са най-силно засегнати от повишена хранителна PPA. Това може да се дължи на по-висока толерантност към PPA или на способността за използване на PPA като източник на енергия, което е доказано вярно за поне един вид, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Алтернативно, излагането на майчина PPA може да подобри развитието на плода, като направи червата на потомството на мишките по-податливи на колонизация с Bacteroidetes; нашият дизайн на проучването обаче не позволи такава оценка.
Метагеномната оценка на съдържанието разкри значителни разлики в изобилието на гени, свързани с метаболизма и производството на PPA, като мишките, изложени на PPA, показват по-голямо изобилие от гени, отговорни за производството на PPA, докато мишките, които не са изложени на PPA, показват по-голямо изобилие от гени, отговорни за метаболизма на PAA (Фигура 6). Тези резултати показват, че ефектът на PPA върху микробния състав може да не се дължи единствено на употребата му, в противен случай изобилието от гени, свързани с метаболизма на PPA, би трябвало да показва по-високо изобилие в чревния микробиом на мишките, изложени на PPA. Едно от обясненията е, че PPA медиира бактериалното изобилие предимно чрез своите антимикробни ефекти, а не чрез използването му от бактериите като хранително вещество. Предишни проучвания показват, че PPA инхибира растежа на Salmonella Typhimurium по дозозависим начин (Jacobson et al., 2018). Излагането на по-високи концентрации на PPA може да селектира бактерии, които са резистентни на неговите антимикробни свойства и може да не са непременно в състояние да го метаболизират или произвеждат. Например, няколко вида Parabacteroides показаха значително по-високо изобилие в проби от PPA, но не бяха открити гени, свързани с метаболизма или производството на PPA (допълнителни таблици 2, 4 и 5). Освен това, производството на PPA като страничен продукт от ферментацията е широко разпространено сред различни бактерии (Gonzalez-Garcia et al., 2017). По-високото бактериално разнообразие може да е причината за по-голямото изобилие на гени, свързани с метаболизма на PPA, в контролните проби (Averina et al., 2020). Освен това, само 27 (2,14%) от 1332 гена се очаква да бъдат гени, свързани изключително с метаболизма на PPA. Много гени, свързани с метаболизма на PPA, участват и в други метаболитни пътища. Това допълнително показва, че изобилието на гени, участващи в метаболизма на PPA, е било по-високо в контролните проби; тези гени могат да функционират в пътища, които не водят до използване или образуване на PPA като страничен продукт. В този случай само един ген, свързан с генерирането на PPA, показа значителни разлики в изобилието между типовете проби. За разлика от гените, свързани с метаболизма на PPA, маркерните гени за производство на PPA бяха избрани, защото те участват пряко в бактериалния път за производство на PPA. При мишки, изложени на PPA, всички видове показаха значително повишено изобилие и капацитет за производство на PPA. Това подкрепя предположението, че PPA биха селектирали продуценти на PPA и следователно биха предсказали, че капацитетът за производство на PPA ще се увеличи. Изобилието на гени обаче не корелира непременно с генната експресия; следователно, въпреки че изобилието на гени, свързани с метаболизма на PPA, е по-високо в контролните проби, скоростта на експресия може да е различна (Shi et al., 2014). За да се потвърди връзката между разпространението на гени, продуциращи PPA, и производството на PPA, са необходими изследвания на експресията на гени, участващи в производството на PPA.
Функционалната анотация на PPA и контролните метагеноми разкри някои разлики. PCA анализът на генното съдържание разкри дискретни клъстери между PPA и контролните проби (Фигура 5). Клъстерирането в рамките на пробите разкри, че контролното генно съдържание е по-разнообразно, докато PPA пробите се групират заедно. Клъстерирането по генно съдържание е сравнимо с клъстерирането по видов състав. По този начин, разликите в изобилието на пътищата са в съответствие с промените в изобилието на специфични видове и щамове в тях. В PPA пробите, два пътя със значително по-високо изобилие са свързани с метаболизма на аминозахари/нуклеотидни захари (ko:K21279) и множество пътища на липиден метаболизъм (ko:K00647, ko:K03801; Допълнителна таблица 3). Известно е, че гените, свързани с ko:K21279, са свързани с рода Bacteroides, един от родовете със значително по-голям брой видове в PPA пробите. Този ензим може да избегне имунния отговор чрез експресиране на капсулни полизахариди (Wang et al., 2008). Това може да обясни увеличението на Bacteroidetes, наблюдавано при мишки, изложени на PPA. Това допълва повишения синтез на мастни киселини, наблюдаван в микробиома PPA. Бактериите използват пътя FASIIko:K00647 (fabB), за да произвеждат мастни киселини, които могат да повлияят на метаболитните пътища на гостоприемника (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020), а промените в липидния метаболизъм могат да играят роля в невроразвитието (Yu et al., 2020). Друг път, показващ повишено съдържание в проби от PPA, е биосинтезата на стероидни хормони (ko:K12343). Има все повече доказателства, че съществува обратна връзка между способността на чревната микробиота да влияе на хормоналните нива и да бъде повлияна от хормоните, така че повишените нива на стероиди могат да имат последици за здравето (Tetel et al., 2018).
Това проучване не е без ограничения и съображения. Важно разграничение е, че не сме извършили физиологични оценки на животните. Следователно не е възможно да се направи директно заключение дали промените в микробиома са свързани с някакво заболяване. Друго съображение е, че мишките в това проучване са били хранени със същата диета като майките си. Бъдещи проучвания могат да определят дали преминаването от диета, богата на PPA, към диета без PPA подобрява ефектите му върху микробиома. Едно ограничение на нашето проучване, както и на много други, е ограниченият размер на извадката. Въпреки че могат да се направят валидни заключения, по-големият размер на извадката би осигурил по-голяма статистическа мощност при анализа на резултатите. Също така сме предпазливи относно правенето на заключения относно връзката между промените в чревния микробиом и каквото и да е заболяване (Yap et al., 2021). Объркващи фактори, включително възраст, пол и диета, могат значително да повлияят на състава на микроорганизмите. Тези фактори могат да обяснят несъответствията, наблюдавани в литературата относно връзката на чревния микробиом със сложни заболявания (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023). Например, е доказано, че членовете на рода Bacteroidetes са или повишени, или намалени при животни и хора с разстройство от аутистичния спектър (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). По подобен начин, проучвания на състава на червата при пациенти с възпалителни заболявания на червата са открили както повишения, така и намаления в едни и същи таксони (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). За да ограничим въздействието на половите пристрастия, ние се опитахме да осигурим равно представителство на половете, така че разликите най-вероятно да се дължат на диетата. Едно от предизвикателствата на функционалната анотация е премахването на излишни генни последователности. Нашият метод за клъстериране на гени изисква 95% идентичност на последователността и 85% сходство по дължина, както и 90% покритие на подравняването, за да се елиминира фалшивото клъстериране. В някои случаи обаче наблюдавахме COG със същите анотации (напр. MUT) (фиг. 6). Необходими са допълнителни изследвания, за да се определи дали тези ортолози са различни, свързани със специфични родове или това е ограничение на подхода за клъстериране на гени. Друго ограничение на функционалната анотация е потенциалната погрешна класификация; бактериалният ген mmdA е известен ензим, участващ в синтеза на пропионат, но KEGG не го свързва с метаболитния път на пропионата. За разлика от това, ортолозите scpB и mmcD са свързани. Големият брой гени без обозначени нокаути може да доведе до невъзможност за идентифициране на гени, свързани с PPA, при оценка на генното изобилие. Бъдещите изследвания ще се възползват от метатранскриптомния анализ, който може да осигури по-задълбочено разбиране на функционалните характеристики на чревната микробиота и да свърже генната експресия с потенциални последващи ефекти. За изследвания, включващи специфични неврологични разстройства или възпалителни заболявания на червата, са необходими физиологични и поведенчески оценки на животни, за да се свържат промените в състава на микробиома с тези разстройства. Допълнителни изследвания, трансплантиращи чревния микробиом в мишки без микроби, също биха били полезни, за да се определи дали микробиомът е двигател или характеристика на заболяването.
В обобщение, ние демонстрирахме, че диетичната PPA действа като фактор за промяна на състава на чревната микробиота. PPA е одобрен от FDA консервант, широко срещан в различни храни, който при дългосрочна експозиция може да доведе до нарушаване на нормалната чревна флора. Открихме промени в изобилието на няколко бактерии, което предполага, че PPA може да повлияе на състава на чревната микробиота. Промените в микробиотата могат да доведат до промени в нивата на определени метаболитни пътища, което може да доведе до физиологични промени, които са от значение за здравето на гостоприемника. Необходими са допълнителни проучвания, за да се определи дали ефектите на диетичната PPA върху микробния състав могат да доведат до дисбиоза или други заболявания. Това проучване полага основите за бъдещи изследвания за това как ефектите на PPA върху състава на червата могат да повлияят на човешкото здраве.
Представените в това проучване набори от данни са достъпни в онлайн хранилища. Името на хранилището и регистрационният номер са: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Това проучване върху животни е одобрено от Комитета за грижа и използване на животни към Университета на Централна Флорида (UCF-IACUC) (номер на разрешение за използване на животни: PROTO202000002). Това проучване е в съответствие с местните закони, разпоредби и институционални изисквания.
НГ: Концептуализация, Куриране на данни, Формален анализ, Изследване, Методология, Софтуер, Визуализация, Писане (оригинален проект), Писане (преглед и редактиране). ЛА: Концептуализация, Куриране на данни, Методология, Ресурси, Писане (преглед и редактиране). SH: Формален анализ, Софтуер, Писане (преглед и редактиране). SA: Проучване, Писане (преглед и редактиране). Главен съдия: Проучване, Писане (преглед и редактиране). SN: Концептуализация, Администриране на проекта, Ресурси, Надзор, Писане (преглед и редактиране). TA: Концептуализация, Администриране на проекта, Надзор, Писане (преглед и редактиране).
Авторите декларират, че не са получили финансова подкрепа за изследването, авторството и/или публикуването на тази статия.
Авторите декларират, че изследването е проведено при липса на каквито и да било търговски или финансови взаимоотношения, които биха могли да се тълкуват като потенциален конфликт на интереси. Не е приложимо.
Всички мнения, изразени в тази статия, са единствено на авторите и не отразяват непременно гледните точки на техните институции, издатели, редактори или рецензенти. Всички продукти, оценени в тази статия, или каквито и да било твърдения, направени от техните производители, не са гарантирани или одобрени от издателя.
Допълнителни материали към тази статия можете да намерите онлайн: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Пропионовата киселина индуцира глиоза и невровъзпаление чрез регулиране на PTEN/AKT пътя при разстройства от аутистичния спектър. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Статистически анализ на данни за състава. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Съотношението Firmicutes/Bacteroidetes като рисков фактор за рак на гърдата. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Диференциален експресионен анализ на данни от броя на последователностите. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI и др. (2013). Фекална микробиота и метаболом при деца с аутизъм и первазивно разстройство на развитието, неуточнено по друг начин. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Аверина О.В., Ковтун А.С., Полякова С.И., Савилова А.М., Ребриков Д.В., Даниленко В.Н. (2020). Бактериални неврометаболитни характеристики на чревната микробиота при малки деца с разстройства от аутистичния спектър. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Бакеро Ф., Номбела К. (2012). Микробиомът като човешки орган. Клинична микробиология и инфекция 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Нови прозрения във физиологията на бактериите, произвеждащи пропионова киселина: Anaerotignum propionicum и Anaerotignum neopropionicum (по-рано Clostridium propionicum и Clostridium neopropionicum). Microorganisms 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Хранене на майката и развитие на плода. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., и Hochberg, J. (1995). Контролиране на процента на фалшиво положителните резултати: Практичен и ефикасен подход към многократното тестване. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Време на публикуване: 18 април 2025 г.