Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка за CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да изключите режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим непрекъсната поддръжка, ще показваме сайта без стилове и JavaScript.
За разлика от гръбначните, се смята, че насекомите нямат полови стероидни хормони, предразположени към мъжките. При Anopheles gambiae, екдизоновият стероид 20-хидроксиекдизон (20E) изглежда е еволюирал, за да контролира развитието на яйцата, когато се синтезира от женски2, и да индуцира рефрактерен период на чифтосване, когато се предава полово от мъжки3. Тъй като развитието на яйцата и чифтосването са основни репродуктивни черти, разбирането как женските комари Anopheles интегрират тези хормонални сигнали би могло да улесни проектирането на нови програми за контрол на маларията. Тук разкриваме, че тези репродуктивни функции се регулират от различни полови стероиди чрез сложна мрежа от ензими, активиращи/инактивиращи екдистероидите. Идентифицирахме специфичен за мъжките окислен екдизон, 3-дехидро-20E (3D20E), който защитава родителството, като изключва женската сексуална рецептивност след сексуален трансфер и активиране чрез дефосфорилиране. Забележително е, че трансферът на 3D20E също така индуцира експресията на репродуктивни гени, които поддържат развитието на яйцата по време на инфекция с Plasmodium, осигурявайки здравето на заразените женски. 20E, получен от женски, не предизвиква сексуален отговор. но позволява на чифтосващите се индивиди да снасят яйца, след като 20E-инхибиращите кинази са инхибирани. Идентифицирането на този мъжко-специфичен насекомен стероиден хормон и неговата роля в регулирането на женската сексуална възприемчивост, плодовитост и взаимодействие с Plasmodium предполага потенциал за намаляване на репродуктивния успех на комарите, предаващи малария.
Случаите на малария и смъртните случаи отново се увеличават4 поради широко разпространената резистентност към инсектициди при комарите Anopheles, единственият вектор на човешки маларийни паразити. Биологията на чифтосване на тези комари е особено привлекателна цел за нови интервенции за контрол на маларията, тъй като женските се чифтосват само веднъж5; стерилизацията на това единично чифтосване би имала голям потенциал за намаляване на популациите на комари на полето.
Жените стават сексуално неспособни след получаване на стероидни хормони с висок титър от мъже. Проучванията показват, че спусъкът за трудности при по-нататъшно чифтосване е 20-хидроксиекдизон (20E), стероиден хормон, по-известен като регулатор на цикъла на линеене в ларвния стадий. Способността на мъжките да синтезират и пренасят 20E се е развила специално при видовете Anopheles, които са част от подрод Cellia7, който е разпространен в Африка и включва най-опасните вектори на малария, включително Anopheles gambiae. Това е особено забележително, защото при тези видове женските също произвеждат 20E след всяко хранене с кръв, а 20E задвижва цикъла на оогенезата (виж реф. 8). Малко се знае обаче за начина, по който женските интегрират сигнали от два различни източника на екдизон (пренос от мъжки и индукция на хранене с кръв), без да компрометират собствената си способност за чифтосване. Всъщност, ако 20E, произведен от женските, предизвика сексуална непоносимост, това ще доведе до безплодие при индивиди, хранещи се девствено, което е много често срещано поведение при тези комари5.
Възможно обяснение е, че мъжките от A. gambiae пренасят модифициран мъжко-специфичен екдизон, който активира сигнална каскада в женския репродуктивен тракт, което води до нестабилност при чифтосване. Въпреки че гръбначните имат множество стероидни хормони, като естроген и андроген (прегледано в реф. 9), доколкото ни е известно, андрогенно-зависими стероиди не са идентифицирани при насекоми.
Зададохме си за цел да определим репертоара на стероидните хормони в мъжката аксесоарна жлеза (MAG) на полово зрелия A. gambiae в търсене на възможни модифициращи стероиди. Използвайки високоефективна течна хроматография, съчетана с тандемна масспектрометрия (HPLC-MS/MS), вместо по-малко специфичния метод, използван преди това, открихме екдизон (E) и 20E в тази тъкан, потвърждавайки предишния резултат. Пробата обаче беше доминирана от окислени фосфорилирани стероиди, съответстващи на формулата 3-дехидро-20E-22-фосфат (3D20E22P)12 (Фигура 1). Други форми включват 3-дехидро-20E (3D20E) и 20E-22-фосфат (20E22P). Интензитетът на HPLC-MS/MS сигнала на 3D20E22P беше с два порядъка по-висок от дефосфорилираната му форма, 3D20E, и с три порядъка по-висок от този на E и 20E (Фигура 1). Въпреки че в други части на тялото и долния репродуктивен тракт... (LRT; Разширени данни Фиг. 1a). Анализирахме също екдистероиди в новозатворени (<1 ден) мъжки и женски индивиди и открихме 3D20E и 3D20E22P само в MAG; E, 20E и 20E22P присъстваха и в двата пола (Разширени данни Фиг. 1b). Тези данни показват, че възрастните мъжки индивиди от A. gambiae произвеждат високи титри на модифициращи хормони в своите MAG, които не се синтезират от женските индивиди.
MAG и женски LRT (включително предсърдия, семенни мехурчета и паровариум) бяха дисектирани от 4-дневни (4-дневни) девствени мъжки и девствени и чифтосани женски (0.5, 3 и 12 hpm). Екдизонът в тези тъкани беше анализиран чрез HPLC-MS/MS (средно ± sem; неспарен t-тест, двустранен, коригиран за процент на фалшиви открития (FDR); NS, незначително; *P < 0.05, **P < 0.01). 3D20E: 3 часа спрямо 0.5 часа, P = 0.035; 12 часа спрямо 3 часа, P = 0.0015; 12 часа спрямо 0.5 часа, P = 0.030. 3D20E22P: 3 часа спрямо 0.5 часа, P = 0.25; 12 часа спрямо 3 часа, P = 0.0032; 12 часа спрямо 0,5 часа, P = 0,015). Данните са от три биологични повторения. Площта на пика за всеки интересуващ ни екдизон е изчислена и нормализирана спрямо броя на комарите. Екдизонът е представен с цветове, както следва: E, зелено; 20E, оранжево; 20E22P, лилаво; 3D20E, синьо; 3D20E22P, розово. Вмъкнатата част увеличава мащаба по оста y, за да покаже по-ниски нива на екдизон.
За да изследваме дали 3D20E22P и 3D20E се прехвърлят по време на чифтосване, дисектирахме женски LRT в различни времеви точки след чифтосване. Въпреки че екдизон не беше открит при девствени самки, наблюдавахме значителни количества 3D20E22P в LRT веднага след чифтосване (0,5 часа след чифтосване, hpm), намаляващи с времето, докато нивата на 3D20E се увеличиха значително (фиг. 1). Използвайки химически синтезиран 3D20E като стандарт, установихме, че нивата на този стероиден хормон в чифтосващите се LRT са поне 100 пъти по-високи от 20E (Разширена таблица с данни 1). По този начин, 3D20E22P е основният мъжки екдизон, който се прехвърля към женските LRT по време на чифтосване, а неговата дефосфорилирана форма, 3D20E, става силно изобилна малко след чифтосване. Това предполага важна роля на последния екдизон в биологията на женските след чифтосване.
След генериране на нов набор от данни за РНК секвениране (RNA-seq) (фиг. 2а), използвайки специално изграден биоинформатичен конвейер, ние търсихме ген за екдизон киназа (EcK), екдизон оксидаза (EO) и екдизон, кодиращ 20E-модифицирана фосфатаза. EPP) се експресира в репродуктивните тъкани. Идентифицирахме един кандидат ген за EPP и два потенциални EcK гена (EcK1 и EcK2), но не успяхме да намерим добър кандидат ген за EO. Забележително е, че отделни EPP гени бяха експресирани във високи нива (98,9-ти персентил) в гамбийските MAG, но не и в женските LRT (фиг. 2b), противно на нашите очаквания, тъй като дефосфорилирането на 3D20E22P се наблюдава в тази женска тъкан. Следователно, ние вярваме, че мъжкият EPP може да бъде прехвърлен по време на чифтосване. Всъщност, ние използвахме in vivo маркиране със стабилни изотопи, за да маскираме женския протеин след чифтосване, ензим, идентифициран чрез MS в женския атриум (фиг. 2в и допълнителна таблица 1). Наличието на EPP в MAG и чифтосани (но не девствени) женски LRT също беше потвърден с помощта на специфични антитела (фиг. 2d).
a, Специално изграден биоинформационен тръбопровод за търсене в репродуктивните тъкани на всеки пол на гени, кодиращи EcKs, EOs и EPPs. Числата до стрелките показват броя на мъжките и женските кандидати на всяка стъпка. Този анализ идентифицира един EPP ген (EPP) и един EcK ген (EcK1), които се експресират при мъжките, и един EcK ген (EcK2), който се експресира и при двата пола, но не дава кандидат EO ген.b, Топлинна карта, сравняваща експресията на кандидат гени в девствени (V) и чифтосващи се (M) тъкани на Anopheles gambiae и Anopheles albicans. Spca, оплождане; MAGs, спомагателни жлези при мъжките; други части на тялото, включително гърди, крила, крака, мастни тела и вътрешни органи и при двата пола, както и яйчници при женските. EcK2 е силно експресиран както в MAG, така и в предсърдията на Гамбия, докато EPP се открива само в MAG.c, Протеомен анализ на транслокацията на мъжка еякуларна група в женски предсърдия на 3, 12 и 24 hpm, показващ 67-те най-изобилни протеина. Женските са отглеждани на диета, съдържаща 15N за маркиране (и маскиране) на всички протеини. Немаркираните мъжки са чифтосани с маркирани женски, а женските LRT са дисектирани на 3, 12 и 24 hpm за протеомен анализ (вижте Допълнителна таблица 1 за пълен списък на еякулаторните протеини). Вмъкнатата част, EPP, Eck1 и EcK2 са открити в MAG на девствени мъжки чрез протеомен анализ на тези тъкани.d, EPP е открит чрез Western blot в MAG и LRT на чифтосани женски, но не и при девствени женски или мъжки, или в останалата част от женското тяло. Мембраните са едновременно сондирани с анти-актин (контрола на зареждането) и анти-EPP антитела. Всички мъжки са девствени. Вижте Допълнителна фигура 1 за данни от гел източника. Western blot анализите са извършени два пъти с подобни резултати.
Екдистероидната фосфофосфатазна активност на EPP беше потвърдена след инкубация чрез HPLC-MS/MS с 3D20E22P, изолиран от MAG (Разширени данни, Фиг. 2a). Освен това, когато заглушихме EPP чрез РНК-медиирана интерференция (RNAi), открихме силно намаляване на фосфатазната активност в репродуктивните тъкани на тези мъжки (Фиг. 3a), а женските, чифтосани с мъжки с EPP-заглушен ген, показаха значително по-нисък дял на дефосфорилиран 3D20E (Фиг. 3b), въпреки частичното генно заглушаване (Разширени данни, Фиг. 2b,c). За разлика от това, не открихме значителни промени в съотношението 20E22P/20E при същите комари, което може да предполага, че ензимът е специфичен за 3D20E22P (Фиг. 3b).
a, Намалена фосфатазна активност в MAG, причинена от заглушаване на EPP, използвайки контроли с двуверижна EPP РНК (dsEPP) или двуверижна GFP РНК (dsGFP). Двадесет MAG пула бяха използвани във всяка реплика (P = 0,0046, сдвоен t-тест, двустранен), представени с отделни точки.b, Женските, чифтосани с мъжки с EPP-заглушен, имаха значително по-нисък дял на дефосфорилиран 3D20E при 3 hpm (P = 0,0043, несдвоен t-тест, двустранен), докато нивата на 20E не бяха засегнати (P = 0,063, несдвоени). t-тест, двустранен). Данните са представени като средна стойност ± sem от три групи от по 13, 16 и 19 женски.c, Женските, чифтосани с мъжки с EPP-заглушен ген, са имали значително по-високи нива на повторно чифтосване (P = 0,0002, точен тест на Фишър, двустранен). Женските първо са били принудени да се чифтосват, за да се гарантира техният чифтосващ статус; 2 дни по-късно те бяха контактувани с други мъжки, носещи трансгенни сперматозоиди, за да се оцени процентът на повторно чифтосване чрез количествено PCR откриване на трансгена.d Женските, хранени с кръв, чифтосани с мъжки с EPP-заглушен ген, имаха значително намалена плодовитост (P < 0,0001; тест на Ман-Уитни, двустранен) и леко намален брой яйца (P = 0,088, тест на Ман-Уитни, двустранен), докато честотата на хвърляне на хайвера не беше засегната (P = 0,94, точен тест на Фишър, двустранен). Във всички панели n представлява броя на биологично независимите проби от комари.NS, не е значимо.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
След това оценихме дали дефосфорилирането на екдизон е важно за индуциране на резистентност към чифтосване при женските. Забележително е, че женските, чифтосани с мъжки с намален EPP, са се чифтосали повторно с много по-висока честота (44,9%) от контролните женски (10,4%), когато са били изложени на допълнителни (трансгенни) мъжки (фиг. 3в). Наблюдавахме също значително намаляване на плодовитостта (фиг. 3d, вляво) и леко намаляване на броя на яйцата, снесени от тези женски (фиг. 3d, в средата), докато процентът на яйцата, снесени от женските (друг отговор, предизвикан при женските чрез чифтосване), не беше засегнат (фиг. 3d, вдясно). Като се има предвид наблюдаваната специфичност на EPP за 3D20E22P, тези резултати показват, че активирането на 3D20E от EPP, прехвърлен по време на чифтосване, може да играе важна роля в изключването на женската възприемчивост към по-нататъшно чифтосване, поведение, което преди това се приписваше на половото прехвърляне на 20E. Следователно, този мъжко-специфичен хормон също силно влияе върху женската плодовитост.
След това сравнихме активността на 20E и 3D20E в инжекционни експерименти при полово зрели девствени самки, използвайки химически синтезиран 3D20E (фиг. 4a-c) и търговски достъпен 20E. Наблюдавахме, че 3D20E е значително по-ефективен от 20E при потискане на чувствителността на женските към чифтосване и при двете концентрации (фиг. 4d). Забележително е, че половината от физиологичното ниво на 3D20E в LRT (1066 pg след инжектиране спрямо 2022 pg след чифтосване) е индуцирало дял на рефрактерни женски, който е бил 20 пъти по-висок от физиологичното ниво на 20E (361 pg след инжектиране) 24 часа след инжектирането при най-високата концентрация 18 pg след чифтосване; Разширена таблица с данни 1). Този резултат е в съответствие с идеята, че половият трансфер на 20E не причинява рефрактерни периоди на чифтосване и допълнително сочи към 3D20E като основен фактор за осигуряване на връзката родител-дете. 3D20E също е значително по-активен от 20E в тестове за снасяне на яйца при девствени женски (фиг. 4д), което предполага, че нормалната скорост на снасяне на яйца, която наблюдавахме след частично заглушаване на EPP, се дължи на наличието на остатъчна 3D20E активност, все още произведена от индуцираните от чифтосване женски фактори.
(a,b) 3D20E, химически синтезиран от 20E (a) с много висока конверсия/ефективност (данните са представени като средна стойност ± sem от три независими реакции на синтез) (b).c, Масспектърът (долната половина) съвпада точно с екдизон, открит в чифтосани женски LRT (горната половина).d, В сравнение с 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; точен тест на Фишър, двустранен) и 10% етанол (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; точен тест на Фишър, двустранен), докато 20E е значително по-висок от контролата само при по-високи дози (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; точен тест на Фишър, двустранен).e, инжектирането на 3D20E индуцира значително по-високи нива на хвърляне на хайвера при девствени женски, отколкото при контролите с 10% етанол (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; точен тест на Фишър, двустранен), докато 20E в сравнение с контролите само при по-високи дози (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; точен тест на Фишър, двустранен). 3D20E индуцира значително по-високи нива на хвърляне на хайвера от 20E при по-високи дози (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; точен тест на Фишър, двустранен). Във всички панели n представлява броя на биологично независимите проби от комари. NS, не е значимо. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Данните са от три... репликира.
В предишни проучвания установихме, че половият трансфер на стероидни хормони индуцира експресията на MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), женски репродуктивен ген, който защитава женските A. gambiae от инфекция с P. falciparum. Здравни разходи, причинени от 13, най-смъртоносния човешки малариен паразит. Като се има предвид значението на MISO за репродуктивната годност на Anopheles в ендемични за малария райони, решихме да определим кой хормон - 3D20E или 20E - задейства експресията на този ген. Установихме, че докато инжектирането на 20E специфично или по-силно индуцира някои ядрени хормонални рецептори (HR), като HR3 и HR4, и типични низходящи стероидни мишени, като йолкогенните гени Vg14, 15, 16, MISO е по-силно индуциран от 3D20E (Разширени данни, Фиг. 3). По този начин, половият трансфер на този андрогенен стероиден хормон изглежда индуцира механизми, които защитават женските от разходите, породени от паразитната инфекция. Освен това, 3D20E различно засяга и двете изоформи на E рецептора EcR, индуцирайки EcR-A и потискайки EcR-B, и по-силно задействайки други гени, индуциращи чифтосване, включително HPX15, който влияе върху женската плодовитост. Това би могло да обясни значителното безплодие, наблюдавано при женски, чифтосани с мъжки с потискащ EPP (Разширени данни, Фиг. 3). Тези данни предполагат съществуването на низходящи пътища, преференциално активирани от два екдизонови хормона, които могат да са в основата на специфичната за пола функция.
След това тествахме функцията на двата EcK гена, идентифицирани в нашия биоинформатичен конвейер. Заглушаването на EcK1 или EcK2 доведе до значителна смъртност при мъжките индивиди (Разширени данни, Фиг. 4a), което предполага, че фосфорилирането на екдизон и следователно инактивирането му е важно за оцеляването. Тъй като EcK2 се експресира на по-високи нива от EcK1 и се открива в MAG чрез протеомика (Фиг. 2b,c и Допълнителна таблица 2), ние валидирахме неговата екдистероидна киназна активност чрез инкубиране с 20E, което доведе до фосфорилиране 20E22P (Разширени данни, Фигура 2).4b). Когато използвахме 3D20E като субстрат, не успяхме да открием фосфорилирания продукт 3D20E22P (Разширени данни, Фиг. 4c), което предполага, че 20E, а не 3D20E, може да е предпочитаната цел на EcK2.
Според нашия RNA-seq анализ, EcK2 също е силно експресиран в долната част на шийните женски, където е изключен след чифтосване (фиг. 2b). Потвърдихме тези данни и определихме, че експресията на EcK2 не е повлияна от храненето с кръв (разширени данни, фиг. 5a). Разширявайки нашите първоначални MS експерименти, установихме, че пикът на 20E22P е тясно свързан с пика на 20E (22-26 часа след хранене с кръв; разширени данни, фиг. 5b). Заглушаването на EcK2 при девствени женски води до 3-кратно увеличение на относителното съотношение на 20E към 20E22P на 26 часа след хранене с кръв (разширени данни, фигури 2c и 5c), потвърждавайки, че EcK2 също фосфорилира 20E при женските. Забележително е, че девствените с намален EcK2 са запазили пълна сексуална рецептивност (разширени данни, фиг. 5d,e), което допълнително предполага, че производството на 20E при женските не индуцира рефрактерни периоди на чифтосване. Тези женски обаче са имали значително... повишени нива на снасяне на яйца в сравнение с контролите, като повече от 30% от девствените рибки снасят яйца (Разширени данни, фиг. 5f). Ако инжекциите с двуверижна Eck2 РНК (dsEcK2) са извършени след хранене с кръв, хвърлянето на хайвера не се е случило, като в този момент пикът на 20E, дължащ се на поглъщане на кръв, е намалял. Като цяло, тези резултати подкрепят модел, че 20E, произведен след смучене на кръв, може да индуцира хвърляне на хайвера, но само когато блокът за хвърляне на хайвера (EcK2 и евентуално други фактори) е изключен чрез чифтосване. Нито инжекциите с 20E, нито 3D20E инхибират експресията на EcK2 при девствени рибки (Разширени данни, фиг. 5g), което предполага, че други фактори медиират инхибирането на тази киназа. Нивата на 20E след хранене с кръв обаче не са достатъчни, за да предизвикат дискомфорт при чифтосване, но са ефективно задействани от високи титри на полово прехвърлена 3D20E.
Нашите резултати предоставят важна информация за механизмите, регулиращи репродуктивния успех на A. gambiae. Появи се модел, при който мъжките индивиди са еволюирали да синтезират високи титри на 3D20E, мъжко-специфичен модифициран екдизон, който осигурява родителство чрез десенсибилизиране на женските към по-нататъшно чифтосване. В същото време, тези маларийни вектори също са еволюирали ефикасна система за активиране на 3D20E при женските индивиди в отговор на половото прехвърляне на мъжко-специфичен EPP. Доколкото ни е известно, това е първият пример за доминирана от мъжки и женски стероидна хормонална система, изпълняваща уникална и критична функция при насекомите. Функцията на мъжко-специфичния екдизон е постулирана, но не е окончателно доказана. Например, до голяма степен опровергана хипотеза 18 е, че тези функции могат да се изпълняват от прекурсора 20E E1. Добре известно е, че при Drosophila монандрията се задейства от половото прехвърляне на малки полови пептиди 19,20, които взаимодействат с неврони, инервиращи женския репродуктивен тракт чрез специфични полови пептидни рецептори 21,22. Необходима е допълнителна работа, за да се определят каскадите на сигнализацията надолу по веригата. контролирани от 3D20E при женски A. gambiae и да се определи дали тези каскади могат да бъдат запазени между комарите и Drosophila.
Като се има предвид важната роля на 3D20E върху женската плодовитост и поведение, идентифицирани в нашето проучване, пътищата, водещи до синтез и активиране на 3D20E, предлагат нови възможности за бъдещи стратегии за контрол на комарите, като например генерирането на конкурентни стерилни мъжки в стратегии за стерилна технология на насекоми, използвани за освобождаване в дивата природа или за имитиране на 3D20E при девствена игра. Специфичната за мъжките функция на 3D20E може да се е развила, когато A. gambiae и други видове Cellia са придобили способността да коагулират спермата си в чифтосващи се тапи, тъй като това позволява ефективен трансфер на голям брой хормони и хормон-активиращи ензими. От своя страна, еволюцията на 3D20E, внедряваща монандрия, осигурява механизъм за женските (чрез висока експресия на MISO), за да се благоприятства репродуктивната им годност в райони с високо разпространение на малария, което косвено допринася за предаването на Plasmodium. Като се има предвид, че е доказано, че женският 20E има дълбоко въздействие върху оцеляването и растежа на P. falciparum при женските комари Anopheles,24 както мъжките, така и женските пътища на стероидни хормони сега са ключови аспекти на взаимодействията между комарите и паразитите.
Щамовете A. gambiae G3 са отглеждани при стандартни условия за насекоми (26-28 °C, 65-80% относителна влажност, 12:12 часа фотопериод светлина/тъмнина). Ларвите са хранени с прахообразна храна за риби (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets и Tetra Pond Sticks в съотношение 7:7:2). Възрастните комари са хранени ad libitum с 10% разтвор на декстроза и седмично с човешка кръв (изследвани кръвни компоненти). Девствените комари са получени чрез разделяне на половете на стадий какавида след изследване на краищата чрез микроскопия. Мъжки, носещи DsRed трансгена, са описани по-рано.
Експериментите с принудително чифтосване бяха проведени съгласно предварително описани протоколи. За естествено чифтосване, 4-дневни девствени женски бяха държани в съотношение 1:3 с полово зрели девствени мъжки в продължение на две нощи. За експерименти, в които мъжките бяха инжектирани с dsEPP, съвместното настаняване в клетки съвпадна с дни 3-4 след инжектирането, когато фосфатазната активност беше максимално заглушена (Разширени данни, Фиг. 2b).
Тъкани от комари, останалите трупове (останалата част от тялото) или цялото тяло бяха дисектирани в 100% метанол и хомогенизирани с микросфера (2 mm стъклени перли, 2400 rpm, 90 sec). Количествата тъкани и обемите на метанол бяха, както следва: останала част от тялото, 50 в 1000 µl; MAG, 50–100 80 µl; женски LRT, 25–50 80 µl. Утайката беше подложена на втора екстракция с метанол със същия обем метанол. Клетъчните остатъци бяха отстранени чрез центрофугиране. Метанолът от двете екстракции беше комбиниран и изсушен под азотен поток, след което ресуспендиран в следните обеми 80% метанол във вода: останала част от тялото, 50 µl; MAGs и женски LRT, 30 µl.
Пробите бяха анализирани на масспектрометър (ID-X, Thermo Fisher), свързан с LC инструмент (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl от пробата бяха инжектирани в 3 µm, 100 × 4.6 mm колона (Inspire C8, Dikma), поддържана при 25 °C. Мобилните фази за LC бяха A (вода, 0.1% мравчена киселина) и B (ацетонитрил, 0.1% мравчена киселина). LC градиентът беше следният: 5% B за 1 минута, след което се увеличи до 100% B за 11 минути. След 8 минути при 100%, колоната се уравновеси отново при 5% B за 4 минути. Дебитът беше 0.3 ml min-1. Йонизацията в MS източника се осъществява чрез нагрята електроспрей йонизация в положителен и отрицателен режим.
Масспектрометърът измерва данни в m/z диапазона от 350 до 680 при резолюция 60 000 в пълен MS режим. MS/MS данните са получени за [M + H]+ (всички мишени), [M - H2O + H]+ (всички мишени) и [M - H]- (фосфорилирани мишени). MS/MS данните са използвани за потвърждаване на екдизоновите свойства на мишени, за които няма наличен стандарт. За идентифициране на нецелеви екдистероиди са анализирани MS/MS данните за всички HPLC пикове с относително изобилие >15%. Количествено определяне с помощта на стандартни криви, създадени от чисти стандарти (20E, 3D20E), за да се изчислят абсолютните количества или разреждания на една специфична проба (всички други мишени), за да се изчисли тяхната еквивалентност на количествата, открити в един мъжки индивид. За 3D20E количественото определяне е извършено с помощта на сумата от следните адукти: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Данните бяха извлечени и количествено определени с помощта на Tracefinder (версия 4.1). MS/MS данните бяха анализирани с помощта на Xcalibur (версия 4.4). MS спектрите на E, 20E и 3D20E бяха сравнени със съответните стандарти. 3D20E22P беше анализиран чрез дериватизация с реагент на Girard. 20E22P беше анализиран чрез m/z съотношение.
3D20E22P беше пречистен от MAG. Пречистването беше извършено в аналитичен мащаб, използвайки ултра-ефективен течен хроматограф (Acquity, Waters) с квадруполен мас-базиран детектор (QDa, Acquity, Waters) при същите LC условия, както при HPLC-MS/MS анализа. Събирането на фракции беше задействано, когато m/z, съответстващ на 3D20E22P, беше открит при същото време на задържане, както е определено преди това. Чистотата на екстрахираните съединения след това беше проверена чрез HPLC-MS/MS, както е описано по-горе.
Тоталната РНК беше екстрахирана от 10-12 репродуктивни тъкани или други части на тялото (без глави), използвайки TRI реагент (Thermo Fisher), следвайки инструкциите на производителя. РНК беше третирана с TURBO DNase (Thermo Fisher). кДНК беше синтезирана, използвайки обратна транскриптаза на Moloney murine leukemia virus (M-MLV RT; Thermo Fisher), следвайки инструкциите на производителя. Праймери за количествена PCR с обратна транскрипция (RT-qPCR; Extended Data Table 2) бяха публикувани преди това24 или проектирани с помощта на Primer-BLAST26, като се предпочитаха продукти с размер 70-150 bp и обхващащи екзон-екзонни връзки или отделни екзони от двойки праймери. кДНК проби от три до четири биологични реплики бяха разредени четирикратно във вода за RT-qPCR. Количественото определяне беше извършено в 15 µl реплики на реакции, съдържащи 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), праймери и 5 µl разредена кДНК. Реакциите бяха проведени на QuantStudio 6 Pro real-time PCR система (Thermo Fisher) и данните бяха събрани и анализирани с помощта на Design and Analysis (версия 2.4.3). Както е показано в това проучване, относителните количества бяха нормализирани спрямо рибозомния ген RpL19 (AGAP004422), чиято експресия не се промени значително при хранене с кръв 27 или чифтосване 3.
Качеството на РНК беше проверено с помощта на Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Библиотеки с двойни краища Illumina бяха подготвени и изпълнени в Broad Institute на MIT и Harvard. Секвениращите четения бяха подравнени с генома на A. gambiae (щам PEST, версия 4.12), използвайки HISAT2 (версия 2.0.5) с параметри по подразбиране. Четения с резултати за качество на картографиране (MAPQ) <30 бяха премахнати с помощта на Samtools (версия 1.3.1). Броят на четенията, картографирани към гени, беше преброен с помощта на htseq-count (версия 0.9.1) с параметри по подразбиране. Нормализираните бройки четения бяха изчислени и диференциалната генна експресия беше анализирана с помощта на пакета DESeq2 (версия 1.28.1) в R (версия 4.0.3).
Кандидатите за гени, модифициращи екдизон, бяха идентифицирани чрез първоначално търсене в генома на A. gambiae, използвайки алгоритъма PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), като бяха използвани стойности по подразбиране на параметрите със следните протеинови секвенции на заявката: от Bombyx mori (номер за достъп NP_001038956.1), Musca domestica (номер за достъп XP_005182020.1, XP_005175332.1 и XP_011294434.1) и Microplitis demolitor (номер за достъп XP_008552646.1 и XP_008552645.1), EcK от B. mori (номер за достъп NP_001036900), Drosophila melanogaster (номер за достъп NP_651202), Apis mellifera. (номер на достъп XP_394838) и Acyrthosiphon pisum (номер на достъп XP_001947166); и EPP от B. mori (номер на достъп XP_001947166) NP_001177919.1 и NP_001243996.1) и EO на D. melanogaster (номер на достъп NP_572986.1) (стъпка 1). След това, филтрирайте попаденията въз основа на висока експресия на mRNA (>100 фрагмента/килобази екзона на милион картирани прочитания (FPKM) или >85%) в репродуктивна тъкан (женски LRT или MAG) в Гамбия (стъпка 2). За да подобрим специфичността, избрахме кандидат ензими, които се експресират и в репродуктивната тъкан на A. albimanus, вид Anopheles, който не синтезира или пренася екдизон по време на чифтосване. Кандидат гените бяха филтрирани въз основа на ниска експресия (<100 FPKM или <85-ти персентил) в репродуктивната тъкан на A. albimanus (стъпка 3). Като последен филтър (стъпка 4), кандидат гените трябва да отговарят на поне едно от следните условия: (1) значително повишена експресия след чифтосване (P < 0,05) според анализа на диференциално експресирани гени и (2) в нерепродуктивни тъкани (< 85% или <100 FPKM).
Модифицирахме предварително описани методи 28,29,30, за да постигнем изотопно маркиране на целия организъм. Накратко, див тип Saccharomyces cerevisiae тип II (YSC2, Sigma) беше тестван в азотна основа на дрожди (BD Difco, DF0335), съдържаща (тегл./об.) 2% глюкоза (G7528, Sigma), 1,7% хранителна среда без аминокиселини и амониев сулфат) и 5% 15N амониев сулфат (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) като единствен източник на азот. Дрождите бяха извлечени чрез центрофугиране и ларвите на комарите бяха хранени ad libitum до какавидиране. Добавено беше рибено брашно (0,5 mg на 300 ларви), за да се предотврати смъртността в четвърти стадий. След това само женски екземпляри бяха използвани в експерименти за чифтосване с немаркирани мъжки екземпляри, за да се анализира мъжкият протеом, прехвърлен по време на чифтосване.
4-6 дневни 15N-маркирани девствени женски са били принудени да се чифтосват с немаркирани девствени мъжки, съответстващи по възраст. Успешното чифтосване е потвърдено чрез откриване на чифтосващи се тапи под епифлуоресцентна микроскопия. На 3, 12 и 24 часа в минута, предсърдията на 45-55 чифтосани женски са били дисектирани в 50 µl амониев бикарбонатен буфер (pH 7.8) и хомогенизирани с пестик. Хомогенатът е центрофугиран и супернатантът е смесен с 50 µl 0.1% RapiGest (186001860, Waters) в 50 mM амониев бикарбонат. Супернатантът и утайката от всяка проба са били замразени бързо върху сух лед и изпратени за една нощ в лабораторията MacCoss в Университета на Вашингтон, където е завършена подготовката на пробата за LC-MS/MS. Ресуспендирайте утайката в 50 µl 0.1% RapiGest в 50 mM амониев бикарбонат и обработете с ултразвук във водна баня. Концентрацията на протеин в утайката и супернатантата е измерена чрез BCA. За анализ, пробите бяха редуцирани с 5 mM дитиотреитол (DTT; Sigma), алкилирани с 15 mM йодоацетамид (Sigma) и инкубирани при 37°C (1:0 50) за 1 час със съотношение трипсинизация:трипсин:субстрат). RapiGest беше лизиран чрез добавяне на 200 mM HCl, последвано от инкубация при 37°C за 45 минути и центрофугиране при 14 000 rpm за 10 минути при 4°C за отстраняване на остатъци. Пробите бяха промити чрез двурежимна твърдофазна екстракция (Oasis MCX патрони, Waters) и ресуспендирани в 0,1% мравчена киселина за крайна концентрация на протеин от 0,33 µg µl-1. Немаркираните MAG протеоми бяха анализирани по подобен начин от девствени мъжки екземпляри. За всяка проба бяха анализирани две аналитични реплики. След това, 1 µg от всяка проба беше анализиран с помощта на 25-cm колона от разтопен силициев диоксид 75 μm с 4-cm... Фритово уловително устройство от разтопен силициев диоксид Kasil1 (PQ), запълнено с обратнофазова смола Jupiter C12 (Phenomenex) и 180-минутна течна хроматография. Разграждане на проби – MS/MS беше проведено на Q-Exactive HF масспектрометър (Thermo Fisher) с nanoACQUITY UPLC система (Waters). Данните, свързани с придобиването на данни, генерирани за всяко протичане, бяха конвертирани в mzML формат, използвайки Proteowizard (версия 3.0.20287) и използвайки Comet31 (версия 3.2) спрямо базата данни FASTA, съдържаща протеинови секвенции от Anopheles gambiae (VectorBase версия 54), Anopheles coluzzi. Беше извършено търсене в Mali-NIH (VectorBase версия 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, март 2021 г.), A. gambiae RNA-seq и три-фреймови транслации на известни човешки замърсители. FDR, съвпадащи с пептидна карта, бяха определени с помощта на Percolator32 (версия 3.05) с праг от 0,01, а пептидите бяха сглобени в протеинови идентификации, използвайки protein parsimony в Limelight33 (версия 2.2.0). Относителното изобилие на протеини беше оценено с помощта на нормализирания фактор на спектрално изобилие (NSAF), изчислен за всеки протеин във всеки цикъл, както е описано по-рано. NSAF спрямо всеки протеин беше осреднен за проби от две различни биологични реплики. 15N маркирането успешно маскира женския протеом, въпреки че малко количество немаркиран протеин може да бъде открито от маркираните девствени проби. Регистрирахме откриване на редукция на мъжки протеин (1-5 спектра) в сурови женски проби само в технически цикъла, където суровите проби бяха анализирани след мъжки/чифтосващи се проби, в резултат на „пренасяне“ чрез HPLC. Отделни протеини, открити като „замърсители“ от маркирани девствени проби, са изброени в Допълнителна таблица 1.
Два антигенни пептида, QTTDRVAPAPDQQQ (в рамките на изотипа PA) и MESDGTTPSGDSEQ (в рамките на изотипа PA и PB) в Genscript. Двата пептида бяха комбинирани, след това конюгирани с носещия протеин KLH и инжектирани в новозеландски зайци. Зайците бяха умъртвени след четвъртата инжекция и общият IgG беше изолиран чрез афинитетно пречистване. IgG от най-специфичния за EPP заек беше използван за по-нататъшно Western blotting.
За Western blots, MAG (n = 10, където n представлява броя на биологично независимите проби от комари) и женски LRT (n = 30) от 4-дневни девствени мъжки и девствени или насилствено чифтосани женски (<10 след чифтосване), буфер за екстракция на протеини (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% натриев деоксихолат; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× коктейл от протеазни инхибитори (Roche)) беше добавен отделно. Пробите бяха хомогенизирани веднага след дисекция с бърнилка (2 mm стъклени перли, 2400 rpm, 90 sec). Неразтворимите остатъци бяха отстранени чрез центрофугиране при 20 000 g при 4°C. Протеините бяха количествено определени чрез Bradford assay (Bio-Rad). След това, 20 µg MAG протеин, 40 µg LRT протеин и 20 µg остатъчен насипен протеин бяха денатурирани и разделени с 10%... Bis-Tris NuPAGE с използване на MOPS буфер. Протеините бяха прехвърлени върху поливинилиден флуоридни мембрани, използвайки iBlot2 трансферна система (Thermo Fisher). Мембраните бяха промити два пъти в 1× PBS-T (0.1% Tween-20 в PBS) и след това блокирани в блокиращ буфер Odyssey (Li-Cor) за 1 час при 22°C. Мембраните бяха разклатени за една нощ при 4°C с персонализирано заешко анти-EPP поликлонално първично антитяло (1:700 в блокиращ буфер) и плъше анти-актиново моноклонално първично антитяло MAC237 (Abeam; 1:4000). Мембраните бяха промити с PBS-T и след това инкубирани с вторични антитела (магарешко анти-заешко 800CW и козе анти-плъше 680LT (Li-Cor), и двете 1:20 000) в блокиращ буфер, съдържащ 0.01% SDS и 0.2% Tween -20 за 1 час при 22°C. Мембраните бяха промити с PBS-T. и са изобразени със скенер Odyssey CLx. Изображенията са събрани и обработени в Image Studio (версия 5.2). Не е открита специфична лента, съответстваща на изоформата на EPP-RA (82 kDa).
Кодиращите региони на EPP (като изоформа AGAP002463-RB, съдържаща хистидин фосфатазен домейн, NCBI търсене на консервиран домейн 34) и EcK2 (AGAP002181) бяха клонирани в плазмид pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); праймерите са изброени в Разширена таблица 2 с данни. Осем GS4 линкера (в тандем) бяха вмъкнати преди C-терминалния 6xHis таг на конструкцията pET-21a(+)-EcK2. Рекомбинантните протеини бяха получени с помощта на реакцията за синтез на протеини NEBExpress без клетки E. coli (New England BioLabs). Рекомбинантните протеини бяха пречистени с помощта на NEBExpress Ni спин колони (New England BioLabs). Контролният протеин с дихидрофолат редуктаза (DHFR) беше получен с помощта на ДНК матрица от NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit. Протеините бяха съхранявани в 50% глицерол в PBS при -20°C до 3 месеца.
Фосфатазната активност на EPP и тъканни екстракти беше измерена с помощта на 4-нитрофенилфосфат (pNPP; Sigma-Aldrich). Реакционният буфер съдържаше 25 mM Tris, 50 mM оцетна киселина, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA и 1 mM DTT. Тъканта беше хомогенизирана в реакционен буфер и клетъчните остатъци бяха отстранени чрез центрофугиране. Реакцията се инициира чрез добавяне на ензим или тъканен екстракт към реакционния буфер, съдържащ 2.5 mg ml-1 pNPP. Реакционната смес се инкубира при стайна температура на тъмно и количеството pNP, превърнато от pNPP, беше количествено определено чрез измерване на абсорбцията при 405 nm в различни моменти от времето.
За in vitro EcK активност, протеинът се инкубира с 0,2 mg 20E или 3D20E в 200 µl буфер (pH 7,5), съдържащ 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP и 10 mM MgCl2 за 2 часа при 27°C. Реакцията се спира чрез добавяне на 800 µl метанол, след което се охлажда при -20°C за 1 час и се центрофугира при 20 000 g за 10 минути при 4°C. Супернатантът след това се анализира чрез HPLC-MS/MS. За да се инактивират чрез топлина протеините, използвани в контролната група, те се инкубират в 50% глицерол в PBS за 20 минути при 95°C.
За in vitro EPP активност, протеинът беше инкубиран с 3D20E22P (еквивалентно на количеството, открито в 18 двойки MAG, пречистени чрез HPLC-MS/MS) в 100 µl буфер (pH 7.5), съдържащ 25 mM Tris, 50 mM оцетна киселина, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA и 1 mM DTT в продължение на 3 часа при 27°C. Реакцията беше спряна чрез добавяне на 400 µl метанол и охладена при -20°C в продължение на 1 час, след което центрофугирана при 20 000 g в продължение на 10 минути при 4°C. Супернатантът беше анализиран чрез HPLC-MS/MS.
PCR фрагменти за EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) и EcK2 (556 bp) бяха амплифицирани от кДНК, приготвена от трупове на комари без глави от различни полови групи. PCR фрагментът на eGFP контролата (495 bp) беше амплифициран от предварително описания pCR2.1-eGFP; PCR праймерите са изброени в Разширена таблица с данни 2. PCR фрагментът е вмъкнат между обърнатите T7 промотори на плазмида pL4440. Плазмидните конструкции са извлечени от NEB 5-α компетентна E. coli (New England Biolabs) и са проверени чрез ДНК секвениране преди употреба (вижте Допълнителни данни 1 за последователността на вмъкване). Праймери, съответстващи на T7 промотора (Разширена таблица с данни 2), са използвани за амплифициране на вмъкването от плазмида, базиран на pL4440. Размерът на PCR продукта е потвърден чрез електрофореза в агарозен гел. dsRNA е транскрибирана от PCR шаблони, използвайки Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) и пречистена съгласно инструкциите на производителя с модификациите, описани по-рано.
За инжектиране на dsRNA, 1380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) е инжектирана в концентрация от 10 ng nl-1 в гръдния кош на възрастни мъжки или женски (Nanoject III, Drummond) в рамките на 1 ден след еклозията. Нивата на генна нокдаун са определени в поне три биологични повторения чрез екстракция на РНК, синтез на кДНК и RT-qPCR. За инжектиране на екдизон, 4-дневни девствени или 6-дневни девствени женски, хранени с кръв, са инжектирани с 0,13, 0,21 или 0,63 µg 20E или 3D20E (Nanoject III, Drummond) в концентрации съответно 1,3, 2,1, в зависимост от експерименталния дизайн или 6,3 ng nl-1. Инжектират се 100 nl 10% (обем/обем) етанол във вода; 100 nl 3D20E22P в 10% етанол (еквивалентно на 75% от количеството, открито в чифт MAGs). Комарите бяха разпределени на случаен принцип в групата за инжектиране.
За анализи на хвърляне на хайвера, 3-дневни женски са били хранени ad libitum с човешка кръв. Отстраняват се частично хранените или нехранените комари. В зависимост от третирането, женските са били поставяни в отделни чашки за хвърляне на хайвера за четири нощи, най-малко 48 часа след хранене с кръв. Яйцата са били преброявани под стереоскоп (Stemi 508, Zeiss); за чифтосани женски, яйцата, които са се излюпили в ларви, са били считани за оплодени.
За опити за чифтосване, на женските е било позволено поне 2 дни, в зависимост от третирането, за да развият резистентност към чифтосване, а мъжки екземпляри от див тип, съответстващи на възрастта, впоследствие са били въведени в същата клетка. Две нощи по-късно, оплодените везикули на женските са били дисектирани и геномната ДНК е била освободена чрез замразяване-размразяване и ултразвукова обработка в буфер, съдържащ 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA и 25 mM NaCl (pH 8.2). Пробите са били инкубирани с протеиназа К (0.86 µg µl-1) за 15 минути при 55°C, последвано от 10 минути при 95°C. Препаратите от сурова геномна ДНК са били разредени 10 пъти и подложени на qPCR детекция на Y хромозомни последователности; праймерите са изброени в Разширена таблица 2 с данни. Липсата на Y хромозомна последователност показва липса на чифтосване.
За анализи на повторно чифтосване, насилствено чифтосаните женски бяха изследвани за наличие на чифтосващи се тапи, за да се потвърди статусът на чифтосване и им бяха оставени 2 дни, за да развият рефрактерност към чифтосване в отсъствието на мъжки, както е описано по-рано 36. Мъжките, носещи DsRed трансгенни сперматозоиди, след това бяха въведени в женски клетки. Две нощи по-късно, торещите везикули бяха дисектирани от женските и геномна ДНК беше приготвена, както е описано по-горе, и подложена на qPCR детекция на DsRed трансгена; праймерите са изброени в Разширена таблица с данни 2. Липсата на DsRed трансгена показва, че не е настъпило повторно чифтосване.
3D20E беше синтезиран както е описано по-рано 37. Накратко, 10 mg от 20E (Sigma-Aldrich) беше разтворен в 10 ml вода, последвано от добавяне на 30 mg платинено черно (под формата на прах, Sigma-Aldrich). Слаба струя O2 беше непрекъснато пропускана през реакционната смес, която беше разбърквана при стайна температура. След 6 часа бяха добавени 30 mL метанол, за да се спре реакцията. Сместа беше центрофугирана за отстраняване на катализаторните частици. Супернатантът беше изпарен до сухо състояние във вакуум при стайна температура. Изсушеният реакционен продукт беше разтворен в 10% етанол и метанол за инжектиране за HPLC-MS/MS анализ. Степента на превръщане (от 20E в 3D20E) беше приблизително 97% (фиг. 4b), а MS спектърът на синтезирания 3D20E съвпадаше с този, открит при чифтосани женски (фиг. 4c).
Легендата съдържа специфични подробности за извършените статистически тестове. GraphPad (версия 9.0) е използван за извършване на точния тест на Фишър, теста на Мантел-Кокс и t-теста на Стюдънт. Тестовете на Кокран-Мантел-Хенцел са извършени с помощта на персонализиран R скрипт (достъпен на https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Разпределението на данните е тествано за нормалност с помощта на теста на Шапиро-Уилк с праг на значимост от 0,05. Когато данните не са преминали теста за нормалност, е извършен тестът на Ман-Уитни. Данните за оцеляване са анализирани с помощта на теста на Мантел-Кокс. Пакетът DESeq2 (версия 1.28.1) е използван за извършване на анализ на диференциалната експресия на ниво ген RNA-seq. Хоризонталната лента на графиката представлява медианата. Стойност на значимост от P = 0,05 е използвана като праг за всички тестове.
За повече информация относно дизайна на изследването вижте резюмето на доклада за изследвания на природата, свързано с тази статия.
MS протеомните данни бяха депозирани в консорциума ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) чрез хранилището на партньорите PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) с идентификатор на набора от данни PXD032157.
Наборът от данни за RNA-seq е депозиран в Изчерпателната библиотека за генна експресия (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) под сериен запис GSE198665.
Допълнителни набори от данни, генерирани и/или анализирани по време на настоящото проучване, могат да бъдат получени от съответните автори при разумно искане. Тази статия предоставя изходните данни.
Де Луф, А. Екдистероиди: Пренебрегвани полови стероиди от насекоми? Мъжки: Black Box. Наука за насекоми. 13, 325–338 (2006).
Редфърн, CPF 20-хидроксиекдизон и развитие на яйчниците при Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).