Javascript е деактивиран във вашия браузър. Някои функции на този уебсайт няма да работят, когато javascript е деактивиран.
Регистрирайте се с вашите специфични данни и конкретно лекарство, което ви интересува, и ние ще съпоставим предоставената от вас информация със статии в нашата обширна база данни и ще ви изпратим PDF копие по имейл незабавно.
Гранулите Ban-Lan-Gen отслабват индуцирания от декстран натриев сулфат хроничен рецидивиращ колит при мишки чрез модулиране на чревната микробиота и възстановяване на производството на чревни SCFA, производни на GLP-1
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Пекински университет, Болница Шънджън, Катедра по фармация, Шънджън, Китайска народна република; 2Здравен научен център на Университета Шънджън, Фармацевтичен факултет, Шънджън, Китайска народна република; 3Медицински университет Гуейджоу, Изследователски център за инженерни технологии на етническа медицина и традиционна китайска медицина, Развитие и приложение на Министерство на образованието, Ключова лаборатория по фармация на провинция Гуейджоу, Медицински университет Гуейджоу, Гуейнг, Китайска народна република; 4 Катедра по гастроентерология, Болница Шънджън към Пекинския университет, Шънджън, Китайска народна република; 5 Фармацевтичен факултет, Медицински университет Гуейджоу, Държавна ключова лаборатория по функция и приложение на лечебните растения, Гуейнг; 6 Катедра по лабораторна медицина, Болница Шенжен към Пекинския университет, Шенжен, Китай [email protected] Шен Сянчун, Фармацевтичен факултет, Медицински университет Гуейджоу, Гуейджоу, Китайска народна република, 550004, имейл [email protected] Цел: Терапията, базирана на GLP-1, е нова възможност за лечение на възпалителни заболявания на червата. Гранулите Ban-Lan-Gen (BLG) са известна антивирусна TCM формула, която проявява потенциална противовъзпалителна активност при лечението на различни възпалителни състояния. Въпреки това, нейният противовъзпалителен ефект върху колита и механизмът ѝ на действие все още не са изяснени. МЕТОДИ: Да се ​​установи хроничен рецидивиращ колит, индуциран от декстран натриев сулфат (DSS), при мишки. Индекси на активност на заболяването, хистологични маркери на увреждане и нива на провъзпалителни цитокини бяха проведени, за да се оцени защитният ефект на BLG. Ефектите на BLG върху чревната микробиота и червата бяха характеризирани чрез серумни нива на GLP-1 и експресия на Gcg, GPR41 и GRP43 в дебелото черво, състав на чревната микробиота, нива на SCFA във фекалиите и освобождаване на GLP-1 от Първични миши колонни епителни клетки, получени от SCFA, произвеждащи GLP-1. Резултати: Лечението с BLG значително намалява загубата на телесно тегло, DAI, скъсяването на дебелото черво, увреждането на тъканите на дебелото черво и нивата на провъзпалителни цитокини на TNF-α, IL-1β и IL-6 в тъканта на дебелото черво. Освен това, лечението с BLG може значително да възстанови експресията на Gcg, GPR41 и GRP43 в дебелото черво и серумните нива на GLP-1 при мишки с колит, и чрез увеличаване на SCFA-продуциращи бактерии като Akkermansia и Prevotellaceae_UCG-001, и намаляване на изобилието от бактерии като Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas и Oscillibacter. Освен това, лечението с BLG може значително да увеличи нивото на SCFA във фекалиите на мишки с колит. В същото време, in vitro експерименти също така показват, че фекален екстракт на третираните с BLG мишки може значително да стимулира секретирането на GLP-1 от първичните малки миши колонни епителни клетки. Заключения: Тези открития показват, че BLG има антиколитен ефект. BLG има потенциал да бъде разработен като терапия, поне отчасти чрез модулиране на чревната микробиота и възстановяване на производството на GLP-1, получен от чревни SCFA. Обещаващи лекарства за хроничен рецидивиращ колит. Ключови думи: колит, Ban-Lan-Gen гранули, чревна микробиота, късоверижни мастни киселини, GLP-1
Улцерозният колит (УК) е дългосрочно възпалително заболяване на дебелото черво и ректума, характеризиращо се с повтаряща се диария, коремна болка, загуба на тегло и мукопурулентни кървави изпражнения.1 Напоследък разпространението на УК се увеличава в страни с преди това ниска честота, включително Китай, с нарастващата популярност на западния начин на живот.2 Това увеличение създава сериозни проблеми за общественото здраве и има сериозни последици за трудоспособността и качеството на живот на пациентите. Важно е да се отбележи, че патогенезата на УК остава до голяма степен неясна, но е общоприето, че генетиката, факторите на околната среда, чревната микробиота и имунната система допринасят за развитието на УК.3 Дори сега няма лечение за УК и целта на лечението е клинично да се контролират клиничните симптоми, да се предизвика и поддържа ремисия, да се насърчи заздравяването на лигавицата и да се намали рецидивите. Класическите лечения включват аминосалицилати, кортикостероиди, имуносупресори и биологични препарати. Тези лекарства обаче не могат да постигнат желания ефект поради различните си странични ефекти.4 Наскоро много казуси показват, че традиционната китайска медицина (ТКМ) е показала голям потенциал за облекчаване на УК. с ниска токсичност, което предполага, че разработването на нови ТКМ терапии е обещаваща стратегия за лечение на улцерозен колит.5-7
Гранулите Banlangen (BLG) са препарат от традиционната китайска медицина, приготвен от водния екстракт на корена Banlangen.8 В допълнение към антивирусната си ефикасност, BLG проявява потенциална противовъзпалителна активност при лечението на различни възпалителни състояния.9,10 Освен това, глюкозинолати (R,S-гоитрин, прогоитрин, епипрорубин и глюкозид са изолирани и идентифицирани от водни екстракти на Radix isatidis) и нуклеозиди (хипоксантин, аденозин, уридин и гуанозин) и индиго алкалоиди като индиго и индирубин.11,12 Предишни проучвания са добре документирали, че съединенията аденозин, уридин и индирубин проявяват мощни антиколитни ефекти при различни животински модели на колит.13-17 Въпреки това, не са провеждани проучвания, основани на доказателства, за оценка на ефикасността на BLG при колит. В настоящото проучване изследвахме защитния ефект на BLG върху хроничен рецидивиращ колит, индуциран от декстран натриев сулфат (DSS), при мишки C57BL/6 и открихме че пероралното приложение на BLG значително отслабва индуцираното от DSS хронично рецидивиращо възпаление на дебелото черво при мишки, неговите регулаторни механизми са свързани с модулация на чревната микробиота и възстановяване на производството на глюкагоноподобен пептид-1 (GLP-1), получен от червата.
BLG гранули (без захар, одобрени от NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Пекин, Китай; партиден номер: 20110966) са закупени от аптеки. DSS (молекулно тегло: 36 000–50 000 далтона) е закупен от MP Biologicals (Санта Ана, САЩ). Сулфасалазин (SASP) (≥ 98% чистота), хематоксилин и еозин са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Миши комплекти за анализ TNF-α, IL-1β и IL-6 luminex Elisa са закупени от R&D systems (Минеаполис, Минесота, САЩ). Оцетна киселина, пропионова киселина и маслена киселина са закупени от Aladdin Industries (Шанхай, Китай). 2-Етилмаслена киселина е закупена от Merck KGaA (Дармщат, Германия).
6-8-седмични мъжки мишки C57BL/6 (телесно тегло 18-22 g) са закупени от Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Пекин, Китай) и са отглеждани в среда с температура 22 ± 2 °C с 12-часов цикъл светлина/тъмнина. Мишките са хранени със стандартна диета за гризачи със свободен достъп до питейна вода в продължение на една седмица, за да се аклиматизират към новата среда. След това мишките са разделени на случаен принцип в четири групи: контролна група, моделна група DSS, група, третирана със SASP (200 mg/kg, перорално) и група, третирана с BLG (1 g/kg, перорално). Както е показано на Фигура 1А, според нашето предишно проучване, експериментален хроничен рецидивиращ колит е индуциран при мишки чрез три цикъла 1,8% DSS в продължение на 5 дни, последвани от дестилирана вода в продължение на 7 дни, според нашето предишно проучване.18 Мишките в групите, третирани със SASP и BLG, са третирани съответно със SASP и BLG всеки ден, започвайки от ден 0. Според предварителните експерименти, дозата на BLG е била определена на 1 g/kg. Междувременно дозата SASP беше определена на 200 mg/kg съгласно литературата.4 Контролната група и групата с DSS модел са получавали един и същ обем вода през целия експеримент.
Фигура 1 BLG облекчава DSS-индуциран хроничен рецидивиращ колит при мишки. (A) Експериментален дизайн на хроничен рецидивиращ колит и лечение, (B) промяна в телесното тегло, (C) резултат от индекса на активност на заболяването (DAI), (D) дължина на дебелото черво, (E) представително изображение на дебелото черво, (F) H&E оцветяване на дебелото черво (увеличение, ×100) и (G) хистологичен резултат. Данните са представени като средна стойност ± SEM (n = 6).##p < 0,01 или ###p < 0,001 спрямо контролната (Con) група; *p < 0,05 или **p < 0,01 или ***p < 0,001 спрямо DSS групата.
Телесното тегло, консистенцията на изпражненията и ректалното кървене бяха регистрирани ежедневно. Индексът на активност на заболяването (DAI) беше определен чрез комбиниране на оценките за телесно тегло, консистенция на изпражненията и ректалното кървене, както е описано по-рано.19 В края на експеримента всички мишки бяха евтаназирани и бяха събрани кръв, изпражнения и дебело черво за по-нататъшни експерименти.
Тъканта на дебелото черво беше фиксирана с формалин и вградена в парафин. Направени бяха 5-микронни срези и оцветени с хематоксилин-еозин (H&E), след което бяха заслепени и оценени, както е описано по-рано.19
Тоталната РНК от тъкан на дебелото черво беше екстрахирана с Trizol реагент (Invitrogen, Carlsbad, CA), последвано от кДНК екстракция с обратна транскриптаза (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Япония). Количествената PCR беше проведена с помощта на PCR система в реално време със SYBR Green Master (Roche, Basel, Швейцария). Транскриптите на целевите гени бяха нормализирани спрямо β-актин и данните бяха анализирани с помощта на метода 2-ΔΔCT. Последователностите на генните праймери са показани в Таблица 1.
Първичната изолация и култивиране на колонни епителни клетки от мишки бяха извършени както е описано по-рано.20 Накратко, колоните на 6-8 седмични мишки първо бяха изрязани след умъртвяване чрез цервикална дислокация, след това надлъжно отворени, третирани с балансиран солен разтвор на Hanks (HBSS, без калций и магнезий) и нарязани на малки парченца с размер 0,5-1 mm. Впоследствие тъканите бяха смлени с 0,4 mg/mL колагеназа XI (Sigma, Poole, UK) в свободна DMEM среда и центрофугирани при 300 xg за 5 минути при стайна температура. Ресуспендирайте утайката в DMEM среда (допълнена с 10% фетален говежди серум, 100 единици/mL пеницилин и 100 µg/mL стрептомицин) при 37°C и прекарайте през найлонова мрежа (размер на порите ~250 µm). Аликвоти от колонни епителни клетки бяха поставени в стъклени съдове и инкубирани с оцетна киселина, пропионова киселина, маслена киселина и екстракти от миши фекалии за 2 часа при 37°C, 5% CO2.
Тъканта на дебелото черво беше хомогенизирана с PBS и нивата на цитокините IL-6, TNF-α и IL-1β в тъканта на дебелото черво бяха открити с помощта на luminex ELISA анализни комплекти (R&D systems, Минеаполис, Минесота, САЩ). По подобен начин, нивата на GLP-1 в серум и културална среда на първични миши епителни клетки на дебелото черво бяха определени с ELISA комплект (Bioswamp, Ухан, Китай) съгласно инструкциите на производителя.
Тоталната ДНК от фекалиите беше екстрахирана с помощта на комплект за екстракция на ДНК (Tiangen, Китай). Качеството и количеството на ДНК бяха измерени съответно при съотношения 260 nm/280 nm и 260 nm/230 nm. Впоследствие, използвайки всяка екстрахирана ДНК като шаблон, бяха използвани специфични праймери 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) и 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) за амплифициране на V3-V4 регионите на 16S rRNA гена в различни региони. PCR продуктите бяха пречистени с помощта на QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Германия), количествено определени чрез PCR в реално време и секвенирани с помощта на платформата за секвениране IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., Калифорния, САЩ). За биоинформатичен анализ обработката на данните беше извършена съгласно предварително описани протоколи.21,22 Накратко, използвайте Cutadapt (V1.9.1) за филтриране на сурови експресни файлове. OTU бяха клъстерирани с помощта на UPARSE (версия 7.0.1001) с гранична стойност на сходство от 97%, а UCHIME беше използван за отстраняване на химерни последователности. Анализът на състава на общността и класификацията бяха извършени с помощта на класификатора RDP (http://rdp.cme.msu.edu/), базиран на базата данни за рибозомни РНК гени SILVA.
Нивата на късоверижни мастни киселини (оцетна киселина, пропионова киселина и маслена киселина) бяха измерени както е описано по-рано от Tao et al., с някои модификации.23 Накратко, 100 mg фекалии първо бяха суспендирани в 0,4 mL дейонизирана вода, последвано от 0,1 mL 50% сярна киселина и 0,5 mL 2-етилмаслена киселина (вътрешен стандарт), след което хомогенизирани и нагряти при 4°C. Центрофугирайте при 12 000 rpm за 15 минути при 50°C. Супернатантът се екстрахира с 0,5 mL етер и се инжектира в GC за анализ. За газова хроматография (GC) пробите се анализират с помощта на газов хроматограф GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.), оборудван с пламъчно-йонизационен детектор (FID). Разделянето се осъществява с помощта на колона ZKAT-624, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Китай). Данните са получени с помощта на софтуер за GC разтвори (Shimadzu, Inc.). Съотношението на разделяне е 10:1, газът-носител е азот, а скоростта на потока е 6 mL/min. Инжектираният обем е 1 μL. Температурата на инжектора и детектора е 300°C. Температурата на пещта се поддържа на 140°C за 13,5 минути, след което се повишава до 250°C със скорост 120°C/min; Температурата се задържа в продължение на 5 минути.
Данните са представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Значимостта на данните е оценена чрез еднофакторен ANOVA, последван от многодиапазонен тест на Дънкан. За всички изчисления е използван софтуерът GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ) и p < 0,05 е считано за статистически значимо.
Добре известно е, че улцерозният колит (УК) е хронично рецидивиращо колитно заболяване със силна коремна болка, диария и кървене. Следователно, DSS-индуциран хроничен рецидивиращ колит при мишки е установен, за да се оцени ефикасността на BLG срещу колит (Фиг. 1A). В сравнение с контролната група, мишките в DSS моделната група са имали значително намалено телесно тегло и по-висок DAI, като тези промени са били значително обърнати след 24 дни лечение с BLG (Фигура 1B и C). Скъсяването на дебелото черво е важен отличителен белег на УК. Както е показано на Фигури 1D и E, дължините на дебелото черво на мишките, получили DSS, са били значително скъсени, но са били облекчени от лечението с BLG. Впоследствие е извършен хистопатологичен анализ за оценка на възпалението на дебелото черво. H&E оцветени изображения и патологични резултати показват, че прилагането на DSS значително нарушава архитектурата на дебелото черво и води до разрушаване на криптите, докато лечението с BLG значително намалява разрушаването на криптите и патологичните резултати (Фигура 1F и G). Забележително е, че защитният ефект на BLG в доза от 1 g/Kg е сравним с този на SASP в доза... от 200 мг/кг. Взети заедно, тези открития показват, че BLG е ефективен за намаляване на тежестта на хроничния рецидивиращ колит, индуциран от DSS, при мишки.
TNF-α, IL-1β и IL-6 са важни възпалителни маркери на възпаление на дебелото черво. Както е показано на Фигура 2А, DSS индуцира значително увеличение на генната експресия на TNF-α, IL-1β и IL-6 в дебелото черво в сравнение с контролната група. Прилагането на BLG може значително да обърне тези DSS-медиирани промени. След това използвахме ELISA, за да определим нивата на възпалителните цитокини TNF-α, IL-1β и IL-6 в тъканта на дебелото черво. Резултатите също така показаха, че нивата на TNF-α, IL-1β и IL-6 в дебелото черво са значително повишени при мишки, третирани с DSS, докато лечението с BLG облекчава тези увеличения (Фигура 2B).
Фигура 2 BLG инхибира генната експресия и производството на провъзпалителните цитокини TNF-α, IL-1β и IL-6 в дебелото черво на мишки, третирани с DSS. (A) Генна експресия на TNF-α, IL-1β и IL-6 в дебелото черво; (B) Нива на TNF-α, IL-1β и IL-6 в дебелото черво. Данните са представени като средна стойност ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 или ##p < 0,01 или ###p < 0,001 спрямо контролната (Con) група; *p < 0,05 или **p < 0,01 спрямо DSS групата.
Чревната дисбиоза е критична в патогенезата на улцерозния колит.24 За да се изследва дали BLG модулира чревната микробиота на мишки, третирани с DSS, е извършено 16S rRNA секвениране, за да се анализира бактериалната общност на чревното съдържимо. Диаграмата на Venn показва, че трите групи споделят 385 OTU. В същото време всяка група има уникални OTU (фиг. 3A). Освен това, индексът Chao1 и индексът Shannon, показани на фигура 3B и C, показват, че разнообразието на чревната микробиота е намалено при мишки, третирани с BLG, тъй като индексът Shannon е значително намален в групата, третирана с BLG. Анализът на главните компоненти (PCA) и анализът на главните координати (PCoA) са използвани за определяне на моделите на клъстериране между трите групи и показват, че структурата на общността на мишки, третирани с DSS, е ясно разделена след лечение с BLG (фигура 3D и E). Тези данни показват, че лечението с BLG значително е повлияло на структурата на общността на мишки с колит, индуциран от DSS.
Фигура 3 BLG променя разнообразието на чревната микробиота при мишки с DSS-индуциран колит. (A) Диаграма на Вен на OTU, (B) Chao1 индекс, (C) Индекс на богатство на Шанън, (D) Графика на резултата от анализа на главните компоненти (PCA) на OTU, (E) Фигура на резултата от анализа на главните координати (PCoA) на OTU. Данните са представени като средна стойност ± SEM (n = 6).**p < 0,01 спрямо DSS групата.
За да оценим специфичните промени във фекалната микробиота, анализирахме състава на чревната микробиота на всички таксономични нива. Както е показано на Фигура 4А, основните типове във всички групи са Firmicutes и Bacteroidetes, следвани от Verrucomicrobia. Относителното разпространение на Firmicutes и съотношенията Firmicutes/Bacteroidetes са значително повишени във фекалните микробни общности на мишки, третирани с DSS, в сравнение с контролните мишки и тези промени са значително обърнати след лечение с BLG. По-специално, лечението с BLG значително увеличава относителното разпространение на Verrucobacterium във фекалиите на мишки с колит, индуциран от DSS. На ниво домакинство фекалните микробни общности са заети от Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae и Prevotellaceae (Фиг. 4B). В сравнение с групата с DSS, изчерпването на BLG увеличава разпространението на Akkermansiaceae, но намалява разпространението на Lachnospiraceae и Ruminococcaceae. Забележително е, че на ниво род, Фекалната микробиота е била заета от Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia и Prevotellaceae_UCG-001 (фиг. 4C). Това откритие също така показва, че BLG лечението ефективно обръща дисбаланса на микробиотата в отговор на DSS предизвикателство, характеризиращо се с намаляване на Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas и Oscillibacter и увеличаване на Akkermansia и Prevotellaceae_UCG-001.
Фигура 4 BLG променя изобилието на чревната микробиота при мишки с колит, индуциран от DSS. (A) Изобилие на чревна микробиота на ниво тип; (B) Изобилие на чревна микробиота на ниво семейство; (C) Изобилие на чревна микробиота на ниво род. Данните са представени като средна стойност ± SEM (n = 6).#p < 0,05 или ###p < 0,001 спрямо контролната (Con) група; *p < 0,05 или **p < 0,01 или ***p < 0,001 спрямо DSS групата.
Като се има предвид, че късоверижните мастни киселини (SCFAs) са основните метаболити на Akkermansia и Prevotellaceae_UCG-001, докато ацетатът, пропионатът и бутиратът са най-разпространените SCFAs в чревния лумен,25-27 все още сме в началото на нашето проучване. Както е показано на Фигура 5, концентрациите на фекален ацетат, пропионат и бутират са значително намалени в групата, третирана с DSS, докато лечението с BLG може до голяма степен да потисне това намаление.
Фигура 5. BLG повишава нивата на SCFAs във фекалиите на мишки с DSS-индуциран колит. (A) Съдържание на оцетна киселина във фекалиите; (B) съдържание на пропионова киселина във фекалиите; (C) съдържание на маслена киселина във фекалиите. Данните са представени като средна стойност ± SEM (n = 6). #p < 0,05 или ##p < 0,01 спрямо контролната (Con) група; *p < 0,05 или **p < 0,01 спрямо DSS групата.
Освен това изчислихме коефициента на корелация на Пиърсън между диференциалните SCFA на ниво род и фекалната микробиота. Както е показано на Фигура 6, Akkermansia е положително корелирана с производството на пропионова киселина (Pearson = 0,4866) и маслена киселина (Pearson = 0,6192). За разлика от това, както Enteromonas, така и Oscillobacter са отрицателно свързани с производството на ацетат, с коефициенти на Пиърсън съответно 0,4709 и 0,5104. По подобен начин, Ruminococcaceae_UCG-014 е отрицателно корелиран с производството на пропионова киселина (Pearson = 0,4508) и маслена киселина (Pearson = 0,5842), съответно.
Фигура 6. Корелационен анализ на Пиърсън между диференциални SCFA и микроби на дебелото черво. (A) Enteromonas с оцетна киселина; (B) Concussion bacillus с оцетна киселина; (C) Akkermansia срещу пропионова киселина; (D) Ruminococcus_UCG-014 с пропионова киселина; (E) Akkermansia с маслена киселина; (F) Ruminococcus _UCG-014 с маслена киселина.
Глюкагоноподобният пептид-1 (GLP-1) е клетъчно-специфичен посттранслационен продукт на проглюкагон (Gcg) с противовъзпалителни свойства.28 Както е показано на Фигура 7, DSS индуцира значително намаляване на експресията на Gcg mRNA. Лечението с дебело черво и BLG може значително да обърне индуцираното от DSS намаление на Gcg в сравнение с контролната група (Фиг. 7A). В същото време, нивото на GLP-1 в серума е значително намалено в групата, третирана с DSS, и лечението с BLG може до голяма степен да предотврати това намаление (Фиг. 7B). Тъй като късоверижните мастни киселини могат да стимулират секрецията на GLP-1 чрез активиране на G-протеин-свързан рецептор 43 (GRP43) и G-протеин-свързан рецептор 41 (GRP41), ние също изследвахме GPR41 и GRP43 в дебелото черво на мишки с колит и установихме, че експресията на GRP43 и GPR41 в дебелото черво на мРНК е значително намалена след DSS предизвикателство, а лечението с BLG може ефективно да възстанови тези намаления (Фигура 7C и D).
Фигура 7 BLG повишава серумните нива на GLP-1 и експресията на Gcg, GPR41 и GRP43 mRNA в дебелото черво при мишки, третирани с DSS. (A) Експресия на Gcg mRNA в тъкан на дебелото черво; (B) Ниво на GLP-1 в серум; (C) Експресия на GPR41 mRNA в тъкан на дебелото черво; (D) Експресия на GPR43 mRNA в тъкан на дебелото черво. Данните са представени като средна стойност ± SEM (n = 5–6).#p < 0,05 или ##p < 0,01 спрямо контролната (Con) група; *p < 0,05 спрямо DSS групата.
Тъй като лечението с BLG може да повиши серумните нива на GLP-1, експресията на Gcg mRNA в дебелото черво и фекалните нива на SCFA при мишки, третирани с DSS, ние допълнително изследвахме ацетата, пропионата и бутирата, както и от контролните (F-Con), DSS колит (F-Con) -DSS) и BLG-третираните колит (F-BLG) мишки, върху освобождаването на GLP-1 от първични миши колонни епителни клетки. Както е показано на Фигура 8А, първичните миши колонни епителни клетки, третирани съответно с 2 mM оцетна киселина, пропионова киселина и маслена киселина, значително стимулираха освобождаването на GLP-1, в съответствие с предишни проучвания.29,30 По подобен начин, всички F-Con, F-DSS и F-BLG (еквивалентни на 0,25 g фекалии) силно стимулираха освобождаването на GLP-1 от първични миши колонни епителни клетки. Забележително е, че количеството GLP-1, освободено от третираните с F-DSS първични миши колонни епителни клетки, беше много по-ниско от това на третираните с F-Con и F-BLG първични мишки. епителни клетки на дебелото черво (Фигура 8B). Тези данни показват, че лечението с BLG значително възстановява чревното производство на GLP-1, получено от SCFA.
Фигура 8 SCFA, получени от BLG, стимулират освобождаването на GLP-1 от първични миши епителни клетки на дебелото черво. (A) Оцетна киселина, пропионова киселина и маслена киселина стимулират освобождаването на GLP-1 от първични миши епителни клетки на дебелото черво; (B) фекални екстракти F-Con, F-DSS и F-BLG стимулират първични миши епителни клетки на дебелото черво. Количество освободен GLP-1. Аликвотни проби от епителни клетки на дебелото черво се поставят в петриеви панички със стъклено дъно и се третират съответно с 2 mM оцетна киселина, пропионова киселина, маслена киселина и фекални екстракти F-Con, F-DSS и F-BLG (еквивалентни на 0,25 g фекалии). 2 часа при 37°C, 5% CO2, съответно. Количеството GLP-1, освободено от първични миши епителни клетки на дебелото черво, се открива чрез ELISA. Данните са представени като средна стойност ± SEM (n = 3). #p < 0,05 или ##p < 0,01 спрямо празна проба или F-Con; *p < 0,05 спрямо F-DSS.
Съкращения: Ace, оцетна киселина; Pro, пропионова киселина; обаче, маслена киселина; F-Con, фекален екстракт от контролни мишки; F-DSS, фекален екстракт от мишки с колит; F-BLG, от третирано с BLG дебело черво. Фекални екстракти от възпалителни мишки.
Класифициран от Световната здравна организация като резистентно заболяване, улцерозният колит се превръща в глобална опасност; Въпреки това, ефективните методи за прогнозиране, предотвратяване и лечение на заболяването все още са ограничени. Следователно, има спешна нужда от проучване и разработване на нови безопасни и ефективни терапевтични стратегии за улцерозен колит (УК). Препаратите от традиционната китайска медицина са обещаващ вариант, тъй като много препарати от традиционната китайска медицина са доказали своята ефективност при лечението на УК при китайското население през вековете и всички те са биологични органични вещества и естествени материали, които са предимно безвредни за хората и животните.31,32 Това проучване имаше за цел да намери безопасен и ефективен препарат от традиционната китайска медицина за лечение на УК и да проучи механизма му на действие. BLG е добре позната китайска билкова формула, използвана за лечение на грип.8,33 Работа в нашата лаборатория и други показа, че индиго, преработен продукт от традиционната китайска медицина от същата суровина като BLG, показва значителна ефикасност при лечението на УК при хора и животни.4,34 Антиколитните ефекти на BLG и неговият механизъм обаче са неясни. В настоящото проучване нашите резултати показват, че BLG ефективно отслабва индуцираното от DSS възпаление на дебелото черво, което е свързано с модулация на чревната микробиота. и възстановяване на производството на GLP-1, получено от червата.
Добре известно е, че улцерозният колит се характеризира с рецидивиращи периоди с типични клинични характеристики, като загуба на тегло, диария, ректално кървене и обширно увреждане на лигавицата на дебелото черво.35 По този начин, хроничният рецидивиращ колит е прилаган чрез прилагане на три цикъла 1,8% DSS в продължение на пет дни, последвано от седем дни пиене на вода. Както е показано на Фигура 1B, колебанията в загубата на тегло и DAI резултатите показват успешно индуциране на хроничен рецидивиращ колит. Мишките в групата, лекувана с BLG, показват възстановяване нагоре от 8-ия ден, което е значително различно от 24-ия ден. Същите промени са наблюдавани и в DAI резултата, което предполага подобрение в клиничното подобрение на колита. По отношение на увреждането на дебелото черво и възпалителния статус, дължината на дебелото черво, увреждането на тъканта на дебелото черво и генната експресия и производството на провъзпалителните цитокини TNF-α, IL-1β и IL-6 в тъканта на дебелото черво също са значително подобрени след лечение с BLG. Взети заедно, тези резултати ясно показват, че BLG е ефективен при лечението на хроничен рецидивиращ колит при мишки.
Как BLG упражнява своите фармакологични ефекти? Многобройни предишни проучвания показват, че чревната микробиота играе ключова роля в патогенезата на улцерозния колит (УК), а терапиите, базирани на микробиома и насочени към микробиома, се очертават като много атрактивна стратегия за лечение на УК. В настоящото проучване ние демонстрирахме, че лечението с BLG води до значителни промени в състава на чревната микробиота, което предполага, че защитният ефект на BLG срещу колит, индуциран от DSS, е свързан с модулация на чревната микробиота. Това наблюдение е в съответствие с идеята, че препрограмирането на хомеостазата на чревната микробиота е важен подход за разбиране на ефикасността на препаратите на ТКМ.36,37 Забележително е, че Akkermansia е грам-отрицателна и строго анаеробна бактерия, която живее в слузния слой на червата, която разгражда муцините, произвежда пропионова киселина, стимулира диференциацията на бокаловидните клетки и поддържа функцията на бариерата на лигавицата.26 Многобройни клинични и животински данни показват, че Akkermansia е силно свързана със здрава лигавица,38 и пероралното приложение на Akkermansia spp. може значително да подобри възпалението на лигавицата.39 Нашите настоящи данни показват, че относителното изобилие на Akkermansia се увеличава значително след лечение с BLG. Освен това, Prevotellaceae_UCG-001 е бактерия, продуцираща SCFA.27 Многобройни проучвания показват, че Prevotellaceae_UCG-001 е открит в ниско относително изобилие във фекалиите на животни с колит.40,41 Нашите настоящи данни също така показват, че лечението с BLG може значително да увеличи относителното изобилие на Prevotellaceae_UCG-001 в дебелото черво на мишки, третирани с DSS. За разлика от това, Oscillibacter е мезофилна, строго анаеробна бактерия.42 съобщава, че относителното изобилие на Oscillibacter е значително повишено при мишки с UC и е значително положително корелирано с нивата на IL-6 и IL-1β и патологичните резултати.43,44 Важно е да се отбележи, че лечението с BLG значително намалява относителното изобилие на Oscillibacter във фекалиите на мишки, третирани с DSS. Важно е да се отбележи, че тези BLG-променени бактерии са най-продуциращите SCFA бактерии. Многобройни предишни проучвания са демонстрирали потенциалните благоприятни ефекти на SCFA. върху възпалението на дебелото черво и защитата на целостта на чревния епител.45,46 Настоящите ни данни също така показват, че концентрациите на SCFA ацетат, пропионат и бутират в третираните с DSS фекалии са значително повишени при третирани с BLG мишки. Взети заедно, тези открития ясно показват, че лечението с BLG може ефективно да подобри индуцираните от DSS SCFA-продуциращи бактерии при мишки с хроничен рецидивиращ колит.
GLP-1 е инкретин, произвеждан главно в илеума и дебелото черво и играе важна роля в забавянето на изпразването на стомаха и понижаването на постпрандиалната кръвна глюкоза.47 Данните сочат, че дипептидил пептидаза (DPP)-4, агонист на GLP-1 рецептора и GLP-1 наномедицина могат ефективно да облекчат чревното възпаление при мишки.48-51 Както е съобщено в предишни проучвания, високите концентрации на SCFA са свързани с плазмените нива на GLP-1 при хора и мишки.52 Нашите настоящи данни показват, че след лечение с BLG, серумните нива на GLP-1 и експресията на Gcg mRNA са значително повишени. По подобен начин, секрецията на GLP-1 е значително повишена в колонни култури след стимулация с фекални екстракти от третирани с BLG мишки с колит в сравнение със стимулация с фекални екстракти от третирани с DSS мишки с колит. Как SCFA влияят върху освобождаването на GLP-1? Gwen Tolhurst et al. съобщават, че SCFA може да стимулира секрецията на GLP-1 чрез GRP43 и GPR41.29 Настоящите ни данни също показват, че лечението с BLG значително увеличава експресията на mRNA на GRP43 и GPR41 в дебелото черво на третирани с DSS мишки. Тези данни показват, че лечението с BLG може да възстанови стимулираното от SCFA производство на GLP-1 чрез активиране на GRP43 и GPR41.
BLG е лекарство без рецепта (OTC) за дългосрочно приложение в Китай. Максималната поносима доза BLG при мишки от Кунмин е 80 g/kg и не е наблюдавана остра токсичност.53 Понастоящем препоръчителната доза BLG (без захар) при хора е 9-15 g/ден (3 пъти дневно). Нашето проучване показа, че BLG в доза 1 g/kg облекчава хроничния рецидивиращ колит, индуциран от DSS, при мишки. Тази доза е близка до дозата BLG, използвана клинично. Нашето проучване също така установи, че механизмът му на действие се медиира, поне отчасти, от промени в чревната микробиота, по-специално от бактерии, продуциращи SCFA, като Akkermansia и Prevotellaceae_UCG-001, за да се възстанови производството на GLP-1, получено от червата. Тези открития показват, че BLG заслужава по-нататъшно разглеждане като потенциален терапевтичен агент за лечение на клиничен колит. Точният механизъм, чрез който той модулира чревната микробиота, обаче остава да бъде потвърден чрез мишки с дефицит на микробиота и фекална бактериална трансплантация.
Ace, оцетна киселина; but, маслена киселина; BLG, пандан; DSS, декстран натриев сулфат; DAI, индекс на активност на заболяването; DPP, дипептидил пептидаза; FID, пламъчно-йонизационен детектор; F-Con, контрола; Фекални екстракти от мишки; F-DSS, фекални екстракти от мишки с DSS колит; F-BLG, фекални екстракти от мишки с колит, третирани с BLG; GLP-1, глюкагоноподобен пептид-1; Gcg, глюкагон; газова хроматография, газова хроматография; GRP43, G протеин-свързан рецептор 43; GRP41, G протеин-свързан рецептор 41; H&E, хематоксилин-еозин; HBSS, балансиран солен разтвор на Hanks; OTC, OTC; PCA, анализ на главните компоненти; PCoA, анализ на главните координати; Pro, пропионова киселина; SASP, сулфасалазин; SCFA, късоверижни мастни киселини; китайска медицина, традиционна китайска медицина; UC, улцерозен колит.
Всички експериментални протоколи бяха одобрени от Комитета по етика на животните към Медицинския център за наука и технологии към Пекинския университет Шенжен-Хонконг (Шенжен, Китай) съгласно Институционалните насоки и Правилника за животните (етичен номер A2020157).
Всички автори са направили значителен принос за концепцията и дизайна, събирането на данни или анализа и интерпретацията на данни; участвали са в изготвянето на статията или критичното преразглеждане на важно интелектуално съдържание; съгласни са да представят ръкописа в текущото списание; окончателно са одобрили версията за публикуване; отговарят за всички аспекти на работата.
Тази работа е подкрепена от Националната фондация за природни науки на Китай (81560676 и 81660479), първокласния проект на университета в Шънджън (86000000210), Фонда на Комитета за иновации в областта на науката и технологиите на Шънджън (JCYJ20210324093810026) и Фонда за изследвания в областта на медицинските науки и технологии на провинция Гуандун (A2020157 и A2020272), фармацията на Медицинския университет в Гуейджоу, провинция Гуейджоу, финансирана от Key Laboratory (YWZJ2020-01) и болницата в Шънджън към Пекинския университет (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B и др. Терапевтичен потенциал на триптолид като противовъзпалително средство при експериментален колит, индуциран от декстран натриев сулфат при мишки. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Каплан Г.Г. Глобалното бреме на възпалителните заболявания на червата (IBD): от 2015 до 2025 г. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727.doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue и др. Алкалоиди, получени от растения: обещаващи модификатори на заболяването при възпалителни заболявания на червата. Prepharmacology.2019;10:351.doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B и др. Indigo Naturalis инхибира оксидативния стрес в дебелото черво и Th1/Th17 отговорите при DSS-индуциран колит при мишки. Oxid Med Cell Longev. 2019; 2019: 9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Чен М, Динг Й, Тонг З. Ефикасност и безопасност на китайското билково лекарство Sophora flavescens (Sophora flavescens) при лечение на улцерозен колит: клинични доказателства и потенциални механизми. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Цао Фанг, Лиу Джие, Ша Бенсин, Пан ХФ. Природни продукти: експериментално ефективни лекарства за лечение на възпалителни заболявания на червата. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913.doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Размисли върху адювантното лечение на улцерозен колит с традиционната китайска медицина. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283.doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT и др. Ефикасност и безопасност на гранулите Banlangen при лечение на сезонен грип: протокол за рандомизирано контролирано проучване.trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x