Сортирането на протеини в секреторния път е от съществено значение за поддържане на клетъчната компартментализация и хомеостаза. В допълнение към сортирането, медиирано от обвивката, ролята на липидите в кинезиновото сортиране в процеса на секреторния транспорт е дългогодишен основен въпрос, на който все още няма отговор. Тук ние извършваме 3D едновременна многоцветна изображения с висока резолюция в реално време, за да докажем in vivo, че новосинтезираните гликозилфосфатидилинозитол-имобилизирани протеини с много дълги керамидни липидни групи са групирани и класифицирани в специализирани ендоплазмени Net изходни места, които са различни от тези, използвани от трансмембранните протеини. Освен това, ние показваме, че дължината на веригата на керамида в мембраната на ендоплазмения ретикулум е критична за тази селективност на сортиране. Нашето проучване предоставя първите директни in vivo доказателства за класифициране на протеиновите товари въз основа на дължината на липидната верига в селективни експортни места в секреторния път.
В еукариотните клетки, протеините, синтезирани в ендоплазмения ретикулум (ЕР), след това се сортират по време на транспорта през секреторния път за доставяне до подходящата им клетъчна дестинация (1). В допълнение към сортирането, медиирано от обвивката, дълго време се предполагаше, че някои липиди могат да служат и като селективни изходни точки, като се групират в специфични мембранни домени, които отговарят за специфични протеини (2-5). Въпреки това, все още липсват директни in vivo доказателства, които да доказват този възможен механизъм, базиран на липиди. За да решим този основен проблем, ние изследвахме при дрожди как гликозилфосфатидилинозитол (GPI) закотвените протеини (GPI-APs) се експортират диференциално от ЕР. GPI-APs са разнообразие от липидно свързани клетъчно-повърхностни протеини (6, 7). GPI-AP е секретиран протеин, прикрепен към външните листчета на плазмената мембрана чрез гликолипидната част (GPI котва). Те приемат GPI котви като консервативни посттранслационни модификации в лумена на ЕР (8). След прикрепването, GPI-AP преминава през апарата на Голджи (5, 9) от ендоплазмения ретикулум (ER) към плазмената мембрана. Наличието на GPI котви кара GPI-AP да се транспортира отделно от трансмембранно секретираните протеини (включително други протеини на плазмената мембрана) по секреторния път (5, 9, 10). В дрождевите клетки, GPI-AP се отделят от другите секретирани протеини в ендоплазмения ретикулум и след това се пакетират в уникални везикули, обвити от комплекс II от обвивни протеини (COPII) (6, 7). Детерминантите на този процес на класификация в процеса на експортиране на ER са неясни, но се предполага, че този механизъм може да изисква липиди, особено структурното ремоделиране на липидната част на GPI котвата (5, 8). В дрождите, GPI липидното ремоделиране започва веднага след прикрепването на GPI и в много случаи кара керамида да се свърже с 26-въглеродната дълговерижна наситена мастна киселина (C26:0) (11, 12). C26 керамидът е основният керамид, произвеждан от дрождевите клетки досега. Синтезира се в ендоплазмения ретикулум (ЕР) и по-голямата част от него се експортира към апарата на Голджи чрез COPII везикули (13). Експортът на GPI-AP от ЕР изисква по-специално непрекъснат синтез на керамид (14, 15) и от своя страна превръщането на керамид в инозитол фосфат керамид (IPC) в апарата на Голджи зависи от синтеза на GPI котва (16). Биофизични изследвания с изкуствени мембрани показват, че керамиди с много дълга ацилна верига могат да се коалесцират, за да образуват подредени домейни с уникални физични свойства (17, 18). Тези данни водят до хипотезата, че C26 керамидът и GPI-AP с C26 керамид използват своите физични свойства, за да се коалесцират в подредени региони или региони в относително хаотичната липидна среда на мембраната на ЕР. Състои се главно от къси и ненаситени глицеролипиди (C16:1 и C18:1) (19, 20). Тези региони ще бъдат селективно фокусирани върху специфични места за излизане от ендоплазмения ретикулум (ERES), където керамидът и базираният на керамид GPI-AP могат да бъдат ко-транспортирани до апарата на Голджи в един и същ специален COPII везикул (5).
В това проучване ние директно тествахме този механизъм, базиран на липиди, като използвахме конфокална микроскопия в реално време със свръхрезолюция (SCLIM), която е авангардна микроскопска техника, позволяваща едновременно да се наблюдават флуоресцентно белязани протеини. Трицветните и триизмерни (3D) изображения имат изключително висока резолюция и скорост в живите клетки (21, 22).
Първоначално приложихме SCLIM технологията, за да определим по-подробно как нормалният GPI-AP с C26 керамидна група е скриниран от трансмембранно секретирани протеини след напускане на ендоплазмичния ретикулум (ER) в S. cerevisiae. За да проверим класификацията на ER, използвахме генетична система, която може директно да визуализира новосинтезиран товар, влизащ в ERES in vivo (7, 23). Като товар избрахме C26 керамиден GPI-AP Gas1, маркиран със зелен флуоресцентен протеин (GFP), и трансмембранно секретиран протеин Mid2, маркиран с близък инфрачервен флуоресцентен протеин (iRFP), като и двата са насочени към плазмената мембрана (24–26). В температурно-чувствителния мутант sec31-1 тези два товара се експресират под галактозо-индуцируем промотор и конститутивен ERES маркер. При екстремна температура (37°C), тъй като мутацията sec31-1 влияе върху функцията на компонента на обвивката на COPII Sec31 да инхибира покълването на COPII и експорта на ER, новосинтезираният товар се натрупва в ER (23). След охлаждане до ниска температура (24°C), мутантните клетки sec31-1 се възстановиха от секреторната област и натрупаният нов синтетичен товар започна да се изнася от ендоплазмения ретикулум (ER). CLIM визуализацията показа, че по-голямата част от новосинтезираните Gas1-GFP и Mid2-iRFP все още се натрупват в ER на мутантните клетки sec31-1 след инкубация при 37°C и след това се освобождават при 24°C за 5 минути (Фигура 1). Тъй като Mid2-iRFP е разпределен по цялата ER мембрана, а Gas1-GFP е концентриран и събран в прекъснатата ER мембранна област, тяхното разпределение е напълно различно (Фигура 1, A до C и Филм S1). Освен това, както е показано на Фигура 1D, клъстерът Gas1-GFP няма Mid2-iRFP. Тези резултати показват, че GPI-AP и трансмембранните протеини са били разделени в различни ER мембранни области рано. Клъстерът Gas1-GFP е в съседство със специфичен ERES, маркиран с mCherry-овия COPII обвивния протеин Sec13 (Фигура 1, E и F, и филм S1) (23).
Клетките sec31-1 експресират галактозо-индуцирани секрети, керамид GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, зелено) с дълга ацилна верига (C26) и трансмембранния протеин Mid2-iRFP (TMP, синьо), и това конструктивно ERES маркиране Sec13-mCherry (ERES, магента) е инкубирано при 37°C за 30 минути, преместено на 24°C и изобразено чрез SCLIM 5 минути по-късно. (A до C) показва представително обединено или единично 2D изображение на равнина (A), 2D проекционно изображение на 10 z-сечения (B) или 3D изображение на клетъчно полукълбо на товарни и ERES маркери (C). Мащабна лента 1μm (A и B). Единицата за мащаб е 0.551μm (C). Gas1-GFP е открит в отделни ER области или клъстери, докато Mid2-iRFP е открит и разпределен в цялата ER мембрана (C). (D) Графиката показва относителния интензитет на флуоресценция на Gas1-GFP и Mid2-iRFP в клъстера Gas1-GFP по линията с бяла стрелка (вляво). AU, произволна единица. (E и F) представляват 3D изображението, което комбинира стоките и маркировката ERES. Клъстерите Gas1-GFP бяха открити близо до специфичния ERES. Единицата за мащаб е 0,551 μm. (F) Бялата плътна стрелка маркира клъстера Gas1-GFP, свързан с ERES. Средният и десният панел показват обединеното уголемено 3D изображение и завъртян изглед на избрания клъстер Gas1-GFP.
Тясната пространствена връзка между клъстера Gas1-GFP и специфичен ERES показва, че Gas1-GFP може да навлезе в селективен ERES, което е различно от селективността, използвана от Mid2-iRFP, за да напусне ER. За да се справим с тази възможност, ние количествено определихме съотношението ERES само за един или два товара (Фигура 2, A до C). Установихме, че повечето ERES (70%) съдържат само един вид товар. Долното изображение на Фигура 2C показва два типични примера за ERES само с Gas1-GFP (Фигура 1) или само с Mid2-iRFP (Фигура 2). За разлика от това, приблизително 20% от ERES съдържат два товара, които се припокриват в една и съща област. Установено е, че някои ERES (10%) съдържат два вида товар, но те са изолирани в ясно различни области. Следователно, този статистически анализ показва, че след експортирането на ER, GPI-AP Gas1-GFP и трансмембранният товар Mid2-iRFP се разделят на различни ERES (Фигура 2D). Тази ефективност на сортиране е много съвместима с предишния биохимичен анализ (6) и морфологично определяне (7). Можем също да наблюдаваме поведението на карантинирания товар, влизащ в ERES (Фигура 2E и Филм S2). Фигура 2E показва, че само малка част от Gas1-GFP (панел 3) или Mid2-iRFP (панел 4) влиза в ERES от едната страна и е ограничена в отделна област. Панел 5 от Фигура 2E показва, че Gas1-GFP и Mid2-iRFP понякога се намират в един и същ ERES, но те влизат от различни страни и са концентрирани в отделни региони, които могат да представляват различни COPII везикули. Също така потвърдихме, че наблюдаваното разделяне и класифициране на C26 керамид-базиран GPI-AP Gas1 като селективен ERES е специфично, тъй като друг трансмембранен секреторен товар, GFP-маркираният плазмен мембранен протеин Axl2 (27), показва подобно поведение на Mid2-iRFP. (Снимка S1 и Филм S3). Новосинтезираният Axl2-GFP се разпределя през ER мембраната подобно на Mid2-iRFP (Фигура S1, A и B) и е колокализиран с Mid2-iRFP в повечето ERES (Фигура S1, B до D). Панели 1 и 2 на Фигура 1. S1C показва два типични примера за ERES, където два трансмембранни товара се припокриват. В тези случаи и двата товара влизат в ERES заедно (Фигура S1E, Панел 3 и Филм S3).
Клетките sec31-1, експресиращи галактозо-индуцируеми секрети, Gas1-GFP (GPI-AP, зелено) и Mid2-iRFP (TMP, синьо) и конститутивно ERES маркиране Sec13-mCherry (ERES, магента), бяха поставени при 37°C. След инкубация в продължение на 30 минути при °C, преместете до 24°C, за да освободите секреторния блок, и изобразете с SCLIM след 20 минути. (A до C) Представителни 2D проекционни изображения (A; мащабна лента, 1μm) или 3D изображения на клетъчни полукълба (B и C; мащабна единица, 0.456μm) на товара и 10 z-сечения, маркирани с ERES. Долният панел в (B) и панелът в (C) показват обработени изображения, за да се покажат само стоките, присъстващи в ERES (магента) [Gas1-GFP (сиво) и Mid2-iRFP (светлосиньо)]. (C) Отворена стрелка: ERES носи само едно парче товар (от 1 до 4). Сива стрелка: ERES съдържа сегрегиран товар (5). Бяла плътна стрелка: ERES, съдържащ съвместно разположен товар. По-долу: Избраният единичен ERES съдържа само Gas1-GFP (1) или Mid2-iRFP (2). Мащабна лента, 100 nm. (D) Количествено определяне на фотомикрографията, описана в (C). Средният процент ERES, който съдържа само един товар (Gas1-GFP или Mid2-iRFP), сегрегиран товар и припокриващ се товар. В три независими експеримента, n=432 в 54 клетки. Лента на грешката = SD. Двустранен неспарен t-тест. *** P = 0,0002. (E) 3D изображение на избрани ERES на карантинен товар, маркиран с (C). Gas1-GFP (зелено) (3) или Mid2-iRFP (синьо) (4) влиза в ERES (магента) от едната страна и е ограничен до малка област в рамките на ERES. Понякога и двата вида товар влизат в един и същ ERES (5) от едната страна и са ограничени до изолирана област в рамките на ERES. Мащабна лента, 100 nm.
След това тествахме хипотеза, че дълговерижният ацил-верижен керамид (C26), присъстващ в ER мембраната, задвижва специфичното клъстериране и сортиране на Gas1 в селективни ERES. За тази цел използвахме модифициран щам дрожди GhLag1, в който двете ендогенни керамид-синтази Lag1 и Lac1 бяха заменени с GhLag1 (хомологът на Lag1 на памука), което доведе до щам дрожди с клетъчна мембрана с керамид, по-къса от тази на дивия тип (Фигура 3А) (28). Масспектрометричният (MS) анализ показа, че в щамовете от див тип 95% от общия керамид е с много дълга (C26) верига, докато в GhLag1 85% от керамида е с много дълга (C18 и C16) верига, само 2% от керамида е с много дълга (C26) верига. Въпреки че C18 и C16 керамидите са основните керамиди, открити досега в мембраната на GhLag1, MS анализът също потвърди, че GPI котвата на Gas1-GFP, експресирана в щама GhLag1, съдържа C26 керамид, който е сравним с липидите от див тип. Качеството е същото (Фиг. 3A) (26). Следователно, това означава, че ензимът за ремоделиране на керамиди Cwh43 е силно селективен за C26 керамид, както е показано на Фигура 26, той преференциално включва GPI котвата от малко количество C26 керамид в щама GhLag1. S2 (29). Въпреки това, клетъчната мембрана на GhLag1 съдържа основно само C18-C16 керамид, докато Gas1-GFP все още съдържа C26 керамид. Този факт прави този щам идеален инструмент за специфично решаване на проблема с дължината на ацилната верига на мембранния керамид в ER. Хипотетичната роля на класа и сортирането. След това, първо изследвахме способността на C26 Gas1-GFP да се натрупва в клъстери в GhLag1 с температурно-чувствителен мутант алел на sec31-1 чрез конвенционална флуоресцентна микроскопия, където само дългата (C18-C16) верига съществува в ER мембраната Ceramide (Фиг. 3). Наблюдавахме, че в sec31-1, по-голямата част от Gas1-GFP е концентрирана в клъстери, докато Gas1-GFP в sec31-1 GhLag1 с дълга (C18-C16) керамид ER мембрана не е предимно клъстериран и разпределен в цялата ER мембрана. За да бъдем точни, тъй като клъстерирането на базата на C26 керамид е тясно свързано със специфични ERES (Фигура 1), след това изследвахме дали този процес може да включва и функцията на механизма на ER експортния протеин. GPI-AP използва специална COPII система за ER експорт, която се регулира активно от структурното ремоделиране на Ted1 на гликановата част на GPI котвата (30, 31). Рекомбинантният GPI-гликан след това се разпознава от трансмембранния карго рецепторен p24 комплекс, който от своя страна селективно набира Lst1, който е специфична изоформа на основната COPII карго свързваща субединица Sec24, образувайки богата на GPI-AP COPII везикула (31-33). Следователно, ние конструирахме двоен мутант, който комбинира делецията на тези единични протеини (компонентът на p24 комплекса Emp24, GPI-гликан ремоделиращият ензим Ted1 и специфичната COPII субединица Lst1) с мутантния щам sec31-1 и ги изследвахме. Възможно ли е да се образува Gas1-клъстер GFP (Фигура 3). Наблюдавахме, че в sec31-1emp24Δ и sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP е предимно неклъстериран и разпределен в цялата ER мембрана, както е наблюдавано по-рано в sec31-1 GhLag1, докато в sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP е като sec31-1. Тези резултати показват, че в допълнение към наличието на C26 керамид в ER мембраната, клъстерирането на Gas1-GFP също трябва да се свърже с p24 комплекса и не изисква специфично набиране на Lst1. След това проучихме възможността дължината на веригата на керамида в ER мембраната да регулира свързването на Gas1-GFP с p24. Установихме обаче, че наличието на C18-C16 керамид в мембраната не влияе върху GPI-гликаните, реконструирани от p24 комплекса (Фигури S3 и S4, A и B), или върху свързването с GPI-AP и експортирането на GPI-AP. Набиране на COPII подтип Lst1 (Фигура S4C). Следователно, C26 керамид-зависимото клъстериране не изисква протеинови взаимодействия с различни механизми на експортен ER протеин, но поддържа алтернативен механизъм за сортиране, задвижван от дължината на липидите. След това анализирахме дали дължината на ацилната верига на керамида в ER мембраната е важна за ефективната класификация на Gas1-GFP като селективен ERES. Тъй като Gas1 в щама GhLag1 с късоверижен керамид напуска ER и навлиза в плазмената мембрана (Фигура S5), ние смятаме, че ако сортирането се обуславя от дължината на ацилната верига на керамида, Gas1 в щама GhLag1 може да бъде пренасочен и кръстосан. ERES стоки със същата мембрана.
(A) Клетъчната мембрана на GhLag1 съдържа главно по-къси C18-C16 керамиди, докато GPI котвата на Gas1-GFP все още има същия C26 IPC като клетките от див тип. По-горе: анализ на дължината на ацилната верига на керамид в клетъчната мембрана на щамове от див тип (Wt) и GhLag1p чрез масспектрометрия (MS). Данните представляват процента на общия керамид. Средната стойност от три независими експеримента. Лента за грешка = SD. Двустранен неспарен t-тест. **** P <0,0001. Долен панел: MS анализ на дължината на ацилната верига на IPC, присъстващ в GPI котвата Gas1-GFP (GPI-IPC), експресирана в щамовете от див тип и GhLag1p. Данните представляват процента на общия IPC сигнал. Средната стойност от пет независими експеримента. Лента за грешка = SD. Двустранен неспарен t-тест. ns, не е важно. P = 0,9134. (B) Флуоресцентни микрографии на sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ и sec31-1lst1Δ клетки, експресиращи индуциран от галактоза Gas1-GFP, бяха инкубирани при 37°C за 30 минути и бяха подложени на рутинна флуоресцентна микроскопия след 24°C. Бяла стрелка: ER Gas1-GFP клъстер. Отворена стрелка: Неклъстериран Gas1-GFP е разпределен по цялата ER мембрана, показвайки характерното за ER оцветяване на ядрения пръстен. Скала, 5μm. (C) Количествено определяне на фотомикрографията, описана в (B). Средният процент клетки с точкова Gas1-GFP структура. В три независими експеримента, n≥300 клетки. Лента на грешката = SD. Двустранен несдвоен t-тест. **** P <0.0001.
За да решим директно този проблем, извършихме SCLIM визуализация на Gas1-GFP и Mid2-iRFP в GhLag1 с температурно-чувствителния мутант алел sec31-1 (Фигура 4 и Филм S4). След като ER беше задържан при 37°C и впоследствие освободен при 24°C, по-голямата част от новосинтезирания Gas1-GFP не беше струпан и разпределен в цялата ER мембрана, както се наблюдава с конвенционални микроскопи (Фигура 4, A и B). Освен това, голям процент от ERES (67%) включва два вида товар, разположени съвместно в него (Фигура 4D). Панели 1 и 2 на Фигура 4C показват два типични примера за ERES с припокриващи се Gas1-GFP и Mid2-GFP. Освен това, и двата товара бяха рекрутирани в един и същ ERES (Фигура 4E, панел 3 и филм S4). Следователно, нашите резултати показват, че дължината на керамидната ацилна верига в ER мембраната е важен фактор за агрегацията и класификацията на ER протеините.
Sec31-1 GhLag1 клетки, експресиращи галактозо-индуцирани секрети, Gas1-GFP (GPI-AP, зелено) и Mid2-iRFP (TMP, синьо) и конститутивен ERES-маркиран Sec13-mCherry (ERES, магента). Инкубирайте при 37°C. Продължете в продължение на 30 минути, понижете до 24°C, за да освободите секретите, и изобразете с SCLIM след 20 минути. (A до C) Представителни 2D проекционни изображения (A; мащабна лента, 1μm) или 3D изображения на клетъчни полукълба (B и C; мащабна единица, 0.45μm) на 10-те z-секции, маркирани с товар и ERES. Долният панел в (B) и панелът в (C) показват обработени изображения, за да се покажат само стоките, присъстващи в ERES (магента) [Gas1-GFP (сиво) и Mid2-iRFP (светлосиньо)]. (C) Бяла запълнена стрелка: ERES, стоките се припокриват. Отворена стрелка: ERES съдържа само един елемент. Долен панел: Избраният ERES има припокриващи се товари (1 и 2), маркирани в (C). Мащабна лента, 100 nm. (D) Количествено определяне на фотомикрографията, описана в (C). В единиците sec31-1 и sec31-1 GhLag1 е включен само един товар (Gas1-GFP или Mid2-iRFP) и средният процент ERES за изолиран товар и припокриващ се товар. В три независими експеримента, n = 432 в 54 клетки (sec31-1) и n = 430 в 47 клетки (sec31-1 GhLag1). Лента на грешката = SD. Двустранен неспарен t-тест. *** P = 0,0002 (sec31-1) и ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D изображение на избран ERES с припокриващ се товар (3), маркиран в (C). Gas1-GFP (зелено) и Mid2-iRFP (синьо) се приближават до ERES (пурпурно) от една и съща страна и остават в една и съща ограничена зона на ERES. Мащабна лента, 100 nm.
Това проучване предоставя директни in vivo доказателства, че протеиновите товари на липидна основа се класифицират в селективни експортни места в секреторния път и разкрива значението на дължината на ациловата верига за селективността на класификацията. Използвайки мощна и съвременна микроскопска техника, наречена SCLIM, ние демонстрирахме новосинтезирания Gas1-GFP (основен GPI-AP на плазмената мембрана с много дълга ацилна верига (C26) керамидна липидна част) в дрождите. Регионите, групирани в дискретни ER, са свързани със специфични ERES, докато трансмембранно секретираните протеини са разпределени в цялата ER мембрана (Фигура 1). Освен това, тези два вида товари влизат селективно в различни ERES (Фигура 2). Дължината на ациловата верига на клетъчния керамид в мембраната е намалена от C26 до C18-C16, клъстерът Gas1-GFP е разрушен в дискретната ER област и Gas1-GFP е пренасочен, за да напусне ER с трансмембранния протеин през същия ERES (Фигура 3 и Фигура 3). 4).
Въпреки че GPI-AP използва специализиран протеинов механизъм за излизане от ERES, ние открихме, че C26 керамид-зависимото разделяне не разчита на диференциални протеинови взаимодействия, които могат да доведат до специализация на ERES (Фигури S4 и S5). Вместо това, нашите открития подкрепят алтернативен механизъм за класификация, воден от клъстериране на протеини на базата на липиди и последващо изключване на други товари. Нашите наблюдения показват, че Gas1-GFP регионът или клъстерът, свързан със специфичен ERES, няма трансмембранно секретирания протеин Mid2-iRFP, което показва, че C26 керамид-зависимият GPI-AP клъстер ще улесни навлизането им в съответния ERES и същевременно ще изключи трансмембранното проникване. Секретите навлизат в този конкретен ERES (Фигури 1 и 2). За разлика от това, наличието на C18-C16 керамиди в ER мембраната не кара GPI-AP да образува региони или клъстери, така че те не изключват или заместват трансмембранно секретираните протеини в същия ERES (Фигури 3 и 4). Следователно, ние предлагаме, че C26 керамидът задвижва разделянето и класификацията, като улеснява групирането на протеини, свързани със специфични ERES.
Как да се постигне това зависимо от C26 керамид групиране в специфична област на ER? Тенденцията на мембранния керамид да се разделя странично може да доведе до образуване на GPI-AP и C26 керамид малки и мигновено подредени липиди в по-неравномерната липидна среда на ER мембраната, съдържаща по-къси и ненаситени глицероллипиди. Качествени клъстери (17, 18). Тези малки временни клъстери могат да бъдат допълнително слети в по-големи, по-стабилни клъстери след свързване с p24 комплекса (34). В съответствие с това, ние показахме, че C26 Gas1-GFP трябва да взаимодейства с p24 комплекса, за да образува по-големи видими клъстери (Фигура 3). p24 комплексът е хетерозиготен олигомер, съставен от четири различни p24 трансмембранни протеина в дрожди (35), който осигурява многовалентно свързване, което може да доведе до омрежване на малки GPI-AP клъстери, като по този начин генерира по-голям стабилен клъстер (34). Взаимодействието между протеиновите ектодомейни на GPI-AP може също да допринесе за тяхната агрегация, както е показано по време на техния Golgi транспорт в поляризирани епителни клетки на бозайници (36). Въпреки това, когато C18-C16 керамид присъства в ER мембраната, когато p24 комплексът се свърже с Gas1-GFP, няма да се образуват големи отделни клъстери. Основният механизъм може да зависи от специфичните физични и химични свойства на дълговерижния ацил-верижен керамид. Биофизични изследвания на изкуствени мембрани показват, че въпреки че както дълговерижните (C24), така и късоверижните (C18-C16) ацил-верижни керамиди могат да причинят фазово разделяне, само дълговерижните ацил-верижни керамиди (C24) могат да насърчат висока кривина и огъване на филма, за да го променят. Чрез взаимно сравнение (17, 37, 38). Показано е, че трансмембранната спирала на TMED2, човешкият хомолог на Emp24, селективно взаимодейства със сфингомиелина на базата на C18 керамид в цитоплазмените лобули (39). Използвайки симулации на молекулярна динамика (MD), открихме, че както C18, така и C26 керамидите се натрупват около цитоплазмените лобули на трансмембранната спирала на Emp24 и имат сходни предпочитания (Фигура S6). Струва си да се отбележи, че това показва, че трансмембранната спирала на Emp24 може да доведе до асиметрично разпределение на липидите в мембраната. Това е скорошен резултат, базиран на клетки на бозайници. Подобни MD симулации също показват наличието на етерни липиди (40). Следователно, предполагаме, че C26 керамидът в двата лобула на ER26 е локално обогатен. Когато GPI-AP в луминалните лобули се свързва директно с многовалентния p24 и натрупването на C26 керамид около p24 в цитоплазмените лобули, това може да насърчи съпътстващата агрегация на протеини и изкривяване на мембраната, генерирани през пръстите (41), което води до разделяне на GPI-AP на дискретни области, съседни на ERES, което също благоприятства силно извитите области на ER мембраната (42). Предишни доклади подкрепят предложения механизъм (43, 44). Многовалентното свързване на олиголектини, патогени или антитела към гликосфинголипиди на основата на керамид (GSL) върху плазмената мембрана предизвиква голяма агрегация на GSL, усилва фазовото разделяне и причинява деформация и интернализация на мембраната (44). Ивабучи и др. (43) Установено е, че в присъствието на дълги (C24), но не и къси (C16) ацилни вериги, многовалентният лиганд, свързан с лактозилцерамид на GSL, индуцира образуването на големи клъстери и инвагинация на мембраната, а цитоплазмената Lyn-медиирана сигнална трансдукция върху листчетата е преплетена от ацилни вериги в свързани неутрофили.
В поляризираните епителни клетки на бозайници, концентрацията на анти-Голджи мрежата (TGN) до нивото на апикалната плазмена мембрана контролира разделянето и сортирането на GPI-AP (10, 45). Тази агрегация се обуславя от GPI-AP олигомеризация (36), но може да зависи и от дължината на керамидната верига, която откриваме в дрождите. Въпреки че GPI-AP при бозайниците има котва на базата на етерни липиди и химичната му структура е много различна от керамида с много дълга ацилна верига, скорошно проучване установи, че и двата липида имат еволюционно сходни физични и химични свойства и функция (40). Следователно, етерната липидна част в клетките на бозайниците може да е подобна на C26 керамида в дрождите и нейната роля е да се свързва с дълговерижния керамид в мембраната, за да насърчи агрегацията и сортирането на GPI-AP. Въпреки че тази възможност все още трябва да бъде тествана директно, предишни открития подкрепят, че транспортът на керамида с дълга ацилна верига до тялото на Голджи не се осъществява от цитоплазмени трансферни протеини, а зависи от синтеза на GPI котви, както при дрождите. Следователно, еволюционният консервативен механизъм изглежда е способен селективно да котранспортира керамид с много дълга ацилна верига и GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) в един и същ транспортен везикул.
В дрождеви и бозайникови поляризирани епителни клетъчни системи, агрегацията и отделянето на GPI-AP от други протеини на плазмената мембрана се случват преди достигане на клетъчната повърхност. Paladino et al. (48) установяват, че върху TGN на бозайникови поляризирани епителни клетки, клъстерирането на GPI-AP е необходимо не само за селективната класификация на GPI-AP към апикалната плазмена мембрана, но също така регулира организацията на клъстериране на GPI-AP и тяхната биологична активност. Клетъчна повърхност. При дрожди това проучване показа, че C26 керамид-зависимият GPI-AP клъстер върху ER може да регулира организацията на клъстерите и функционалната активност на GPI-AP върху плазмената мембрана (24, 49). В съответствие с този модел, GhLag1 клетките са алергични към GPI инхибитори или лекарства, които засягат целостта на клетъчната стена (28), и необходимостта от функционални Gas1-GFP клъстери (49) на върха на керамида, проектиран при чифтосването на дрождеви клетки, показва G​​​ Възможни физиологични последици от hLag1 клетки. Грешка в GPI-AP. Въпреки това, по-нататъшно тестване дали функционалната организация на клетъчната повърхност е програмирана от ендоплазмения ретикулум (ER) чрез метод за сортиране, базиран на дължината на липидите, ще бъде предмет на нашите бъдещи изследвания.
Щамовете Saccharomyces cerevisiae, използвани в тази работа, са изброени в Таблица S1. Щамовете MMY1583 и MMY1635 на SCLIM за изобразяване на живи клетки са конструирани на фона на W303. Тези щамове, експресиращи Sec13-mCherry с флуоресцентен протеинов маркер, са конструирани с помощта на метод, базиран на полимеразна верижна реакция (PCR), с плазмид pFA6a като матрица (23). Щамът, експресиращ Mid2-iRFP, маркиран с флуоресцентен протеин под контрола на GAL1 промотора, е конструиран както следва. PCR амплификация на iRFP-KanMx последователност от pKTiRFP-KAN вектор (дар от E. O'Shea, Addgene плазмид номер 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; идентификатор на изследователски ресурс (RRID): Addgene_64687) и вмъкната в C-края на ендогенния Mid2. След като геномната последователност Mid2-iRFP беше амплифицирана и клонирана в GAL1 промотора, тя беше интегрирана в Not I-Sac I сайта на интеграционния плазмид pRS306. Полученият плазмид pRGS7 беше линеаризиран с Pst I, за да се интегрира в URA3 локуса.
Генът за сливане Gas1-GFP се експресира под контрола на GAL1 промотора в центромерния (CEN) плазмид, който е конструиран както следва. Последователността Gas1-GFP е амплифицирана чрез PCR от плазмида pRS416-GAS1-GFP (24) (дар от L. Popolo) и клонирана в Xma I–Xho I сайта на CEN плазмида pBEVY-GL LEU2 (дар от C). Miller; Addgene плазмид номер 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Полученият плазмид е наречен pRGS6. Генът за сливане Axl2-GFP също се експресира под контрола на GAL1 промотора на вектора pBEVY-GL LEU2 и неговата конструкция е както следва. Axl2-GFP секвенцията беше амплифицирана от плазмида pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) чрез PCR и клонирана в Bam HI-Pst I сайта на вектора pBEVY-GL LEU2. Полученият плазмид беше наречен pRGS12. Последователността на олигонуклеотидите, използвани в това изследване, е изброена в Таблица S2.
Щамът е допълнен с 0,2% аденин и 2% глюкоза [YP-декстроза (YPD)], 2% рафиноза [YP-рафиноза], богата на екстракт от дрожди, протеинова p (YP) среда (1% екстракт от дрожди и 2% протеин ept). (YPR)] или 2% галактоза [YP-галактоза (YPG)] като източник на въглерод, или в синтетична минимална среда (0,15% азотна основа от дрожди и 0,5% амониев сулфат) за допълване на подходящи аминокиселини и основи, необходими за хранене, и съдържаща 2% глюкоза (синтетична минимална среда с глюкоза) или 2% галактоза (синтетична минимална среда с галактоза) като източник на въглерод.
За изобразяване в реално време, температурно-чувствителни sec31-1 мутантни клетки, експресиращи конструкцията под GAL1 промотора, бяха култивирани в YPR среда при 24°C в продължение на една нощ до средата на log фазата. След индукция в YPG при 24°C за 1 час, клетките бяха инкубирани в SG при 37°C за 30 минути и след това прехвърлени при 24°C за освобождаване от секреторния блок. Конканавалин А беше използван за фиксиране на клетките върху предметно стъкло и изобразяване чрез SCLIM. SCLIM е комбинация от инвертен флуоресцентен микроскоп Olympus IX-71 и маслена леща UPlanSApo 100×1.4 с числова апертура (Olympus), високоскоростен конфокален скенер с въртящ се диск и високо съотношение сигнал/шум (Yokogawa Electric), персонализиран спектрометър и персонализирано охлаждане. Усилвателят на изображението на системата (Hamamatsu Photonics) може да осигури система от увеличителни лещи с крайно увеличение от ×266.7 и камера със зарядно свързано устройство, която умножава електрони (Hamamatsu Photonics) (21). Заснемането на изображения се извършва чрез персонализиран софтуер (Yokogawa Electric). За 3D изображения използвахме персонализиран пиезоелектричен задвижващ механизъм, за да вибрира обективната леща вертикално, и събрахме оптичните части на разстояние 100 nm една от друга в стек. Z-стековото изображение се преобразува в 3D вокселни данни, а теоретичната функция за разпространение на точки, използвана за конфокалния микроскоп с въртящ се диск, се използва за деконволюционна обработка чрез софтуера Volocity (PerkinElmer). Чрез използване на софтуера Volocity за автоматично определяне на прагове за анализ на колокацията, ERES, включително товар, беше измерен. Анализът на линейно сканиране беше извършен с помощта на софтуера MetaMorph (Molecular Devices).
Използвайте софтуера GraphPad Prism, за да определите статистическата значимост. За двустранния t-тест на Стюдънт и обикновения еднофакторен ANOVA тест, разликите между групите се считат за имащи значително влияние върху P <0,05 (*).
За флуоресцентна микроскопия на Gas1-GFP, клетките в логаритмична фаза бяха култивирани за една нощ в YPD и събрани чрез центрофугиране, промити два пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор и инкубирани върху лед за поне 15 минути, след което обработени под микроскоп, както е описано по-рано (24). За придобиване на данни беше използван микроскоп Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS), оборудван с обектив, L5 (GFP) филтър, камера Hamamatsu и софтуер Application Suite X (LAS X).
Пробите бяха денатурирани с SDS пробен буфер при 65°C за 10 минути и след това разделени чрез SDS-полиакриламидна гел електрофореза (PAGE). За имуноблотинг анализ, 10 μl проба бяха заредени на лента. Първично антитяло: Използвайте заешки поликлонални анти-Gas1 в разреждане 1:3000, заешки поликлонални анти-Emp24 в разреждане 1:500 и заешки поликлонални анти-GFP (дар от H. Riezman) в разреждане 1:3000. Мишето моноклонално анти-Pgk1 антитяло беше използвано в разреждане 1:5000 (дар от J. de la Cruz). Вторично антитяло: Кози анти-заешки имуноглобулин G (IgG), конюгиран с хрянова пероксидаза (HRP), използван в разреждане 1:3000 (Pierce). HRP-конюгиран кози анти-миши IgG беше използван в разреждане 1:3000 (Pierce). Зоната на имунния отговор е наблюдавана чрез хемилуминесцентния метод на реагент SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Както е описано в (31), върху обогатената ER фракция е проведен експеримент с естествена имунопреципитация. Накратко, дрождевите клетки се промиват с TNE буфер [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM фенилметилсулфонил флуорид и смес от протеазен инхибитор) при 600 nm (OD600) при 100 оптична плътност два пъти. Той се разбива със стъклени перли, след което клетъчните остатъци и стъклените перли се отстраняват чрез центрофугиране. Супернатантът след това се центрофугира при 17 000 g за 15 минути при 4°C. Утайката се ресуспендира в TNE и се добавя дигиталисов сапонин до крайна концентрация от 1%. Суспензията се инкубира за 1 час с въртене при 4°C, след което неразтворимите компоненти се отстраняват чрез центрофугиране при 13 000 g при 4°C за 60 минути. За имунопреципитация с Gas1-GFP, първо предварително инкубирайте пробата с празни агарозни перли (ChromoTek) при 4°C за 1 час, след което инкубирайте с GFP-Trap_A (ChromoTek) при 4°C за 3 часа. Имунопреципитираните перли бяха промити пет пъти с TNE, съдържащ 0,2% дигоксигенин, елуирани с SDS пробен буфер, разделени на SDS-PAGE и анализирани чрез имуноблотинг.
Както е описано в (31), определянето на омрежването беше извършено върху обогатената ER фракция. Накратко, обогатената ER фракция беше инкубирана с 0,5 mM дитиобис(сукцинимидил пропионат) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 минути). Реакцията на омрежване беше прекъсната чрез добавяне на глицин (крайна концентрация 50 mM, 5 минути, 20°C).
Както е описано по-рано (50), беше извършен MS анализ на керамид в щамове от див тип и GhLag1. Накратко, клетките бяха култивирани до експоненциална фаза (3 до 4 OD600 единици/ml) в YPD при 30°C и бяха събрани 25×107 клетки. Метаболизмът им беше спрян с трихлороцетна киселина. Използва се екстракционен разтворител [етанол, вода, етер, пиридин и 4.2 N амониев хидроксид (15:15:5:1:0.018 v/v)] и 1.2 nmol вътрешен стандарт C17 керамид (860517, Avanti polary lipid) качество). Използвайте монометиламинов реагент [метанол, вода, n-бутанол и разтвор на метиламин (4:3:1:5 v/v)] за извършване на лека алкална хидролиза на екстракта, след което използвайте наситен с вода n-бутанол за обезсоляване. Накрая, екстрактът беше ресуспендиран в разтворител с положителен режим [хлороформ/метанол/вода (2:7:1) + 5 mM амониев ацетат] и инжектиран в масспектрометъра. Беше извършен мултиреакционен мониторинг (MRM) за идентифициране и количествено определяне на сфинголипидни молекули. Третичният квадруполен масспектрометър TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) е оборудван с роботизиран нанопоточен йонен източник Nanomate HD (Advion Biosciences, Итака, Ню Йорк) за липиден анализ. Енергията на сблъсък е оптимизирана за всяка категория керамиди. MS данните бяха получени в положителен режим. За всяко биологично повторение, липидният сигнал е медианата на три независими измервания.
Както е описано в (31), клетките (800×107), експресиращи Gas1-GFP, бяха подложени на естествена имунопреципитация. Пречистеният Gas1-GFP беше отделен чрез SDS-PAGE и прехвърлен върху поливинилиден флуоридна (PVDF) мембрана. Протеинът беше визуализиран чрез оцветяване на PVDF с амидно черно. Gas1-GFP лентата беше отрязана от PVDF и промита 5 пъти с метанол и веднъж с вода с качество за течна хроматография-MS (LC-MS). Чрез инкубиране на мембранната лента с 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), буфер и 500μl прясно разтворена 1 M смес от натриев нитрит при 37°C в продължение на 3 часа, липидната фракция се освобождава от Gas1-GFP и се лизира. Освобождаването на инозин фосфат керамид между глюкозамин и инозитол (51). След това мембранната лента беше промита четири пъти с вода с качество за LC-MS, изсушена при стайна температура и съхранявана в азотна атмосфера при -80°C до анализа. Като контрола за всеки експеримент е използвана празна проба от PVDF мембрана. Липидът, екстрахиран от Gas1-GFP, след това е анализиран чрез MS, както е описано (50). Накратко, PVDF лентите, съдържащи GPI-липид, са ресуспендирани в 75 μl отрицателен разтворител за плесен [хлороформ/метанол (1:2) + 5 mM амониев ацетат] и са преминали през електроспрей йонизационен (ESI)-MRM/MS анализ на сфинголипидни видове (TSQ Vantage). В този случай, MS данните са получени в режим на отрицателни йони.
Както бе споменато по-рано, липидната част на GPI котвата беше отделена от GPI-AP, белязан с [3H]-инозитол (16). Липидите бяха разделени чрез тънкослойна хроматография, използвайки система от разтворители (55:45:10 хлороформ-метанол-0.25% KCl) и визуализирани с помощта на FLA-7000 (Fujifilm).
Клетките, експресиращи Gas1-GFP (600×107), бяха промити два пъти с TNE буфер и разчупени със стъклени перли, след което центрофугирани за отстраняване на клетъчните остатъци и стъклените перли. Супернатантът след това беше центрофугиран при 17 000 g за 1 час при 4°C. Утайката беше промита в TNE и инкубирана с 1 U PI-PLC (Invitrogen) в TNE, съдържащ 0,2% дигиталисов сапонин, за 1 час при 37°C. След ензимната обработка, мембраната беше отстранена чрез центрофугиране при 17 000 g при 4°C за 1 час. За имунопреципитация на Gas1-GFP, супернатантът беше инкубиран с GFP-Trap_A (ChromoTek) при 4°C за една нощ. Пречистеният Gas1-GFP, отделен чрез SDS-PAGE, беше оцветен с Coomassie brilliant blue. Оцветяващата лента Gas1-GFP беше отрязана от сивото около акведукта и след алкилиране с йодоацетамид и редукция с дитиотреитол беше извършено in-gel смилане с трипсин. Триптични пептиди и пептиди с GPI-гликани бяха екстрахирани и изсушени. Изсушеният пептид беше разтворен в 20 μl вода. Инжектирайте порция (8 μl) в течния кристален хроматограф. За разделяне на пептидите при специфични градиентни условия беше използвана октадецилсиланова (ODS) колона (Develosil 300ODS-HG-5; вътрешен диаметър 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, префектура Айчи, Япония). Мобилната фаза е разтворител А (0.08% мравчена киселина) и разтворител Б (0.15% мравчена киселина в 80% ацетонитрил). Използвана е Accela HPLC система (Thermo Fisher Scientific, Бостън, Масачузетс) за елуиране на колоната с разтворител А в рамките на 55 минути при скорост на потока от 50 μl min-1 за 5 минути, след което концентрацията на разтворител B е увеличена до 40%. (Thermo Fisher Scientific, САЩ). Елуатът е въвеждан непрекъснато в ESI йонния източник, а триптичните пептиди и пептидите с GPI-гликани са анализирани чрез LTQ Orbitrap XL (хибриден линеен йонен капан-орбитрап масспектрометър; Thermo Fisher Scientific). В MS настройката напрежението на капилярния източник е настроено на 4,5 kV, а температурата на трансферния капиляр е поддържана на 300°C. Напрежението на капиляра и напрежението на тръбната леща са настроени съответно на 15 V и 50 V. MS данните са получени в режим на положителни йони (резолюция 60 000; точност на масата 10 части на милион) в масов диапазон от 300/m/z съотношение маса/заряд (m/z) 3000. MS/MS данните са получени чрез йонния капан в LTQ Orbitrap XL [първите 3 цифри, от които зависят данните, дисоциация, индуцирана от сблъсък (CID)].
MD симулациите бяха извършени с помощта на софтуера GROMACS (52) и силово поле MARTINI 2 (53-55). След това беше използван CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) за конструиране на бислой, съдържащ диолеоилфосфатидилхолин (DOPC) и Cer C18 или DOPC и Cer C26. Топологията и координатите на Cer C26 са получени от DXCE чрез премахване на допълнителните перли от сфингозиновата опашка. Използвайте описания по-долу процес, за да балансирате двойния слой и да го стартирате, след което използвайте последните координати на системата, за да изградите система, съдържаща Emp24. Трансмембранният домейн на дрождевия Emp24 (остатъци 173 до 193) беше конструиран като α-спирала, използвайки инструмента за визуална MD (VMD) молекулярна структура (58). След това, след отстраняване на припокриващите се липиди, протеинът беше едро гранулиран и вмъкнат в бислоя, използвайки CHARMM GUI. Крайната система съдържа 1202 DOPC и 302 Cer C26 или 1197 DOPC и 295 Cer C18 и Emp24. Системата се йонизира до концентрация от 0,150 M. Направени са четири независими повторения за два двуслойни състава.
Липидният бислой се балансира с помощта на CHARMM GUI процеса, който включва минимизиране и след това балансиране на 405 000 стъпки, където ограниченията за позиция постепенно се намаляват и елиминират, а времевата стъпка се увеличава от 0,005 ps до 0,02 ps. След уравновесяване, той произвежда 6 µs с времева стъпка от 0,02 ps. След вмъкване на Emp24, използвайте същия CHARMM GUI процес, за да минимизирате и балансирате системата, и след това я стартирайте за 8 s в производствен режим.
За всички системи, по време на процеса на балансиране, налягането се контролира от баростата на Берендсен (59), а по време на производствения процес налягането се контролира от баростата на Паринело-Рахман (60). Във всички случаи средното налягане е 1 бар и се използва полуизотропна схема за свързване на налягането. В процеса на балансиране и производство се използва термостат (61) с повторно калибриране на скоростта, за да се свърже температурата съответно на протеиновите, липидните и разтворителните частици. По време на цялата операция целевата температура е 310K. Несвързващото взаимодействие се изчислява чрез генериране на списък за сдвояване, използвайки схемата на Верле с буферен толеранс 0,005. Членът на Кулон се изчислява, използвайки реакционното поле и гранично разстояние от 1,1 nm. Членът на Вандер-Ваалс използва гранична схема с гранично разстояние от 1,1 nm, а граничната схема на Верле се използва за потенциален дрейф (62).
Използвайки VMD, граничната дължина на вълната между DOPC фосфатни перли или керамидни AM1 перли и протеина е 0,7 nm и се изчислява броят на липидите, които взаимодействат с протеина. Съгласно следната формула, изчислете фактора на изчерпване-обогатяване (DE), както е показано в (63): DE фактор = (количеството общи липиди в протеина 0,7) в протеина 0,7 (количеството Cer в общите липиди)
Докладваната стойност се получава като средна стойност, а границите на грешките са четири независими копия на SE. Статистическата значимост на DE фактора се изчислява чрез t-тест [(среднаDE-фактор-1)/SE]. Изчислете P стойността от едностранното разпределение.
Инструментът GROMACS беше използван за изчисляване на 2D латералната карта на плътността на системата, съдържаща Emp24, в рамките на последните 250 ns от трасирането. За да се получи картата на обогатяване/изчерпване на керамид, картата на плътността на Cer се разделя на сумата от картата на Cer и DOPC, и след това се разделя на концентрацията на Cer в тялото. Използва се същата скала на цветната карта.
За допълнителни материали към тази статия, моля, вижте http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Това е статия с отворен достъп, разпространявана съгласно условията на Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, който позволява използването, разпространението и възпроизвеждането във всякакъв носител, стига крайната употреба да не е за търговска печалба и предпоставката е, че оригиналното произведение е коректно. Справка.
Забележка: Молим ви да предоставите имейл адреса си само за да знае човекът, когото препоръчвате на страницата, че искате да види имейла и че не е спам. Няма да събираме никакви имейл адреси.
Този въпрос се използва, за да се провери дали сте посетител и да се предотврати автоматичното изпращане на спам.
София Родригес-Галярдо, Казуо Курокава, Сузана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомез), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксилиадора Агилера-Ромеро, Ана Мария Перес -Линеро), Серхио Лопес (Серхио Лопес), Михо Уага (Miho Waga), Мисако Арман (Misako Arman), Мияко Риман (Miyako Riman), Проу Акира, Стефано Фани, Акихико Накано, Мануел Мунис
3D изображения с висока резолюция в реално време разкриват значението на дължината на керамидната верига за сортиране на протеини в селективни изходни сайтове.
София Родригес-Галярдо, Казуо Курокава, Сузана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомез), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксилиадора Агилера-Ромеро, Ана Мария Перес -Линеро), Серхио Лопес (Серхио Лопес), Михо Уага (Miho Waga), Мисако Арман (Misako Arman), Мияко Риман (Miyako Riman), Проу Акира, Стефано Фани, Акихико Накано, Мануел Мунис
3D изображения с висока резолюция в реално време разкриват значението на дължината на керамидната верига за сортиране на протеини в селективни изходни сайтове.
©2020 Американска асоциация за напредък на науката. всички права запазени. AAAS е партньор на HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.