Благодарим ви, че посетихте nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS. За най-добро изживяване препоръчваме да използвате най-новата версия на браузъра (или да изключите режима на съвместимост в Internet Explorer). Освен това, за да се гарантира непрекъсната поддръжка, този сайт няма да включва стилове или JavaScript.
Сероводородът (H2S) има множество физиологични и патологични ефекти върху човешкото тяло. Натриевият хидросулфид (NaHS) се използва широко като фармакологичен инструмент за оценка на ефектите на H2S в биологични експерименти. Въпреки че загубата на H2S от разтвори на NaHS отнема само няколко минути, разтвори на NaHS са използвани като донорни съединения за H2S в питейната вода в някои проучвания върху животни. Това проучване изследва дали питейната вода с концентрация на NaHS от 30 μM, приготвена в бутилки за плъхове/мишки, може да остане стабилна в продължение на поне 12–24 часа, както предлагат някои автори. Пригответе разтвор на NaHS (30 μM) в питейна вода и веднага го изсипете в бутилки за вода за плъхове/мишки. Пробите бяха събрани от върха и вътрешността на бутилката за вода на 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 и 24 часа, за да измерите съдържанието на сулфид, използвайки метода с метиленово синьо. Освен това, мъжки и женски плъхове са инжектирани с NaHS (30 μM) в продължение на две седмици, а серумните концентрации на сулфид са измервани през ден през първата седмица и в края на втората седмица. Разтворът на NaHS в пробата, получена от върха на бутилката с вода, е нестабилен; той намалява със 72% и 75% съответно след 12 и 24 часа. В проби, взети от вътрешността на бутилките с вода, намалението на NaHS не е значително в рамките на 2 часа; въпреки това, то намалява с 47% и 72% съответно след 12 и 24 часа. Инжектирането на NaHS не повлиява серумното ниво на сулфид при мъжки и женски плъхове. В заключение, разтвори на NaHS, приготвени от питейна вода, не трябва да се използват за даряване на H2S, тъй като разтворът е нестабилен. Този път на приложение ще изложи животните на нередовни и по-малки от очакваните количества NaHS.
Сероводородът (H2S) се използва като токсин от 1700 г.; възможната му роля като ендогенна биосигнална молекула обаче е описана от Абе и Кимура през 1996 г. През последните три десетилетия са изяснени множество функции на H2S в различни човешки системи, което води до осъзнаването, че донорните молекули на H2S могат да имат клинични приложения при лечението или управлението на определени заболявания; вижте Chirino et al. за скорошен преглед.
Натриевият хидросулфид (NaHS) е широко използван като фармакологичен инструмент за оценка на ефектите на H2S в много изследвания върху клетъчни култури и животни5,6,7,8. NaHS обаче не е идеален донор на H2S, тъй като бързо се превръща в H2S/HS- в разтвор, лесно се замърсява с полисулфиди и лесно се окислява и изпарява4,9. В много биологични експерименти NaHS се разтваря във вода, което води до пасивно изпаряване и загуба на H2S10,11,12, спонтанно окисление на H2S11,12,13 и фотолиза14. Сулфидът в оригиналния разтвор се губи много бързо поради изпаряване на H2S11. В отворен контейнер, полуживотът (t1/2) на H2S е около 5 минути, а концентрацията му намалява с около 13% на минута10. Въпреки че загубата на сероводород от разтвори на NaHS отнема само няколко минути, някои проучвания върху животни са използвали разтвори на NaHS като източник на сероводород в питейната вода в продължение на 1–21 седмици, като са замествали разтвора, съдържащ NaHS, на всеки 12–24 часа.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Тази практика не е в съответствие с принципите на научните изследвания, тъй като дозите на лекарствата трябва да се основават на употребата им при други видове, особено при хора.27
Предклиничните изследвания в биомедицината имат за цел да подобрят качеството на грижите за пациентите или резултатите от лечението. Резултатите от повечето проучвания върху животни обаче все още не са приложени върху хора28,29,30. Една от причините за този транслационен неуспех е липсата на внимание към методологичното качество на проучванията върху животни30. Следователно, целта на това проучване беше да се изследва дали 30 μM разтвори на NaHS, приготвени в бутилки за вода за плъхове/мишки, могат да останат стабилни в питейната вода в продължение на 12–24 часа, както се твърди или предлага в някои проучвания.
Всички експерименти в това проучване са проведени в съответствие с публикуваните насоки за грижа и използване на лабораторни животни в Иран31. Всички експериментални доклади в това проучване също са следвали насоките ARRIVE32. Етичната комисия на Института по ендокринни науки към Медицинския университет „Шахид Бехещи“ одобри всички експериментални процедури в това проучване.
Цинков ацетат дихидрат (CAS: 5970-45-6) и безводен железен хлорид (CAS: 7705-08-0) са закупени от Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Франция). Натриев хидросулфид хидрат (CAS: 207683-19-0) и N,N-диметил-p-фенилендиамин (DMPD) (CAS: 535-47-0) са закупени от Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, САЩ). Изофлуран е закупен от Piramal (Bethlehem, PA, САЩ). Солна киселина (HCl) е закупена от Merck (Darmstadt, Германия).
Пригответе разтвор на NaHS (30 μM) в питейна вода и веднага го изсипете в бутилките за вода за плъхове/мишки. Тази концентрация е избрана въз основа на множество публикации, използващи NaHS като източник на H2S; вижте раздела „Дискусия“. NaHS е хидратирана молекула, която може да съдържа различни количества хидратационна вода (т.е. NaHS•xH2O); според производителя, процентът на NaHS, използван в нашето проучване, е 70,7% (т.е. NaHS•1,3 H2O) и ние взехме тази стойност предвид в нашите изчисления, където използвахме молекулно тегло от 56,06 g/mol, което е молекулното тегло на безводния NaHS. Хидратационната вода (наричана още кристализационна вода) са водните молекули, които изграждат кристалната структура33. Хидратите имат различни физични и термодинамични свойства в сравнение с анхидратите34.
Преди да добавите NaHS към питейната вода, измерете pH и температурата на разтворителя. Незабавно изсипете разтвора на NaHS в бутилката за вода за плъхове/мишки в клетката на животните. Проби бяха събрани от върха и от вътрешността на бутилката за вода на 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 и 24 часа, за да се измери съдържанието на сулфид. Измерванията на сулфиди бяха направени веднага след всяко вземане на проба. Получихме проби от върха на епруветката, защото някои проучвания показват, че малкият размер на порите на епруветката може да сведе до минимум изпарението на H2S15,19. Този проблем изглежда се отнася и за разтвора в бутилката. Това обаче не беше така за разтвора в гърлото на бутилката за вода, който имаше по-висока скорост на изпаряване и се самоокисляваше; всъщност животните пиеха първо тази вода.
В изследването са използвани мъжки и женски плъхове Wistar. Плъховете са отглеждани в полипропиленови клетки (2–3 плъха на клетка) при стандартни условия (температура 21–26 °C, влажност 32–40%) с 12 часа светлина (от 7:00 до 19:00 часа) и 12 часа тъмнина (от 19:00 до 7:00 часа). Плъховете са имали свободен достъп до чешмяна вода и са били хранени със стандартна храна (Khorak Dam Pars Company, Техеран, Иран). Съответстващи по възраст (6 месеца) женски (n=10, телесно тегло: 190–230 g) и мъжки (n=10, телесно тегло: 320–370 g) плъхове Wistar са разделени на случаен принцип в контролна група и група, третирана с NaHS (30 μM) (n=5 на група). За да определим размера на извадката, използвахме подхода KISS (Keep It Simple, Stupid), който комбинира предишен опит и статистически анализ35. Първоначално проведохме пилотно проучване върху 3 плъха и определихме средното ниво на общ сулфид в серума и стандартното отклонение (8,1 ± 0,81 μM). След това, като се има предвид мощността от 80% и се приема двустранно ниво на значимост от 5%, определихме предварителен размер на извадката (n = 5 въз основа на предишна литература), който съответстваше на стандартизиран размер на ефекта от 2,02 с предварително определената стойност, предложена от Фестинг за изчисляване на размера на извадката от експериментални животни35. След умножаване на тази стойност по стандартното отклонение (SD) (2,02 × 0,81), прогнозираният размер на откриваемия ефект (1,6 μM) беше 20%, което е приемливо. Това означава, че n = 5/група е достатъчно за откриване на 20% средна промяна между групите. Плъховете бяха разделени на случаен принцип в контролни и третирани с NaSH групи, използвайки функцията за случайни данни на софтуера Excel36 (Допълнителна фигура 1). Заслепяването беше извършено на ниво резултат и изследователите, извършващи биохимичните измервания, не бяха запознати с разпределението на групите.
Групите от двата пола, приемащи NaHS, са третирани с 30 μM разтвор на NaHS, приготвен в питейна вода, в продължение на 2 седмици; пресен разтвор е подаван на всеки 24 часа, като през това време е измервано телесното тегло. Кръвни проби са събирани от върховете на опашките на всички плъхове под изофлуранова анестезия през ден в края на първата и втората седмица. Кръвните проби са центрофугирани при 3000 g за 10 минути, серумът е отделен и съхраняван при –80°C за последващо измерване на серумната урея, креатинин (Cr) и общ сулфид. Серумната урея е определена чрез ензимен уреазен метод, а серумният креатинин е определен чрез фотометричен метод на Jaffe, като са използвани търговски достъпни комплекти (Man Company, Техеран, Иран) и автоматичен анализатор (Selectra E, сериен номер 0-2124, Холандия). Вътре- и между-анализните коефициенти на вариация за урея и Cr са по-малки от 2,5%.
Методът с метиленово синьо (MB) се използва за измерване на общия сулфид в питейна вода и серум, съдържащ NaHS; MB е най-често използваният метод за измерване на сулфид в насипни разтвори и биологични проби11,37. MB методът може да се използва за оценка на общия сулфиден пул38 и за измерване на неорганични сулфиди под формата на H2S, HS- и S2 във водната фаза39. При този метод сярата се утаява като цинков сулфид (ZnS) в присъствието на цинков ацетат11,38. Утаяването с цинков ацетат е най-широко използваният метод за отделяне на сулфиди от други хромофори11. ZnS се разтваря отново с HCl11 при силно киселинни условия. Сулфидът реагира с DMPD в стехиометрично съотношение 1:2 в реакция, катализирана от железен хлорид (Fe3+ действа като окислител), за да образува багрилото MB, което се открива спектрофотометрично при 670 nm40,41. Границата на откриване на MB метода е приблизително 1 μM11.
В това проучване, 100 μL от всяка проба (разтвор или серум) бяха добавени в епруветка; след това бяха добавени 200 μL цинков ацетат (1% w/v в дестилирана вода), 100 μL DMPD (20 mM в 7,2 M HCl) и 133 μL FeCl3 (30 mM в 1,2 M HCl). Сместа беше инкубирана при 37°C на тъмно в продължение на 30 минути. Разтворът беше центрофугиран при 10 000 g за 10 минути и абсорбцията на супернатантата беше отчетена при 670 nm с помощта на микроплаков четец (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). Концентрациите на сулфиди бяха определени с помощта на калибрационна крива на NaHS (0–100 μM) в ddH2O (Допълнителна фигура 2). Всички разтвори, използвани за измерванията, бяха прясно приготвени. Вътрешно- и междулабораторните коефициенти на вариация за измервания на сулфиди бяха съответно 2,8% и 3,4%. Определихме също така общото количество сулфид, възстановено от проби от питейна вода и серум, съдържащи натриев тиосулфат, използвайки метода на обогатената проба42. Възстановяванията за проби от питейна вода и серум, съдържащи натриев тиосулфат, бяха съответно 91 ± 1,1% (n = 6) и 93 ± 2,4% (n = 6).
Статистическият анализ беше извършен с помощта на софтуера GraphPad Prism версия 8.0.2 за Windows (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния, САЩ, www.graphpad.com). Използван беше сдвоен t-тест за сравняване на температурата и pH на питейната вода преди и след добавянето на NaHS. Загубата на H2S в разтвора, съдържащ NaHS, беше изчислена като процентно намаление спрямо изходното ниво на усвояване и за да се оцени дали загубата е статистически значима, проведохме еднофакторен ANOVA с повторни измервания, последван от тест за множествено сравнение на Dunnett. Телесното тегло, серумната урея, серумният креатинин и общият серумен сулфид във времето бяха сравнени между контролни и третирани с NaHS плъхове от различен пол, използвайки двуфакторен смесен (между-в рамките) ANOVA, последван от post hoc тест на Bonferroni. Двустранни P стойности < 0,05 се считат за статистически значими.
PH на питейната вода беше 7,60 ± 0,01 преди добавяне на NaHS и 7,71 ± 0,03 след добавяне на NaHS (n = 13, p = 0,0029). Температурата на питейната вода беше 26,5 ± 0,2 и се понижи до 26,2 ± 0,2 след добавяне на NaHS (n = 13, p = 0,0128). Пригответе 30 μM разтвор на NaHS в питейната вода и го съхранявайте в бутилка за вода. Разтворът на NaHS е нестабилен и концентрацията му намалява с времето. При вземане на проби от гърлото на бутилката за вода се наблюдава значително намаление (68,0%) в рамките на първия час, а съдържанието на NaHS в разтвора намалява съответно със 72% и 75% след 12 и 24 часа. В проби, получени от бутилки за вода, намалението на NaHS не е значително до 2 часа, но след 12 и 24 часа то е намаляло съответно с 47% и 72%. Тези данни показват, че процентът на NaHS в 30 μM разтвор, приготвен в питейна вода, е намалял до приблизително една четвърт от началната стойност след 24 часа, независимо от мястото на вземане на проби (Фигура 1).
Стабилност на разтвор на NaHS (30 μM) в питейна вода в бутилки за плъхове/мишки. След приготвяне на разтвора, проби са взети от върха и вътрешността на бутилката за вода. Данните са представени като средна стойност ± SD (n = 6/група). * и #, P < 0,05 в сравнение с времето 0. Снимката на бутилката за вода показва върха (с отвора) и тялото на бутилката. Обемът на върха е приблизително 740 μL.
Концентрацията на NaHS в прясно приготвения 30 μM разтвор беше 30,3 ± 0,4 μM (диапазон: 28,7–31,9 μM, n = 12). След 24 часа обаче концентрацията на NaHS намаля до по-ниска стойност (средно: 3,0 ± 0,6 μM). Както е показано на Фигура 2, концентрациите на NaHS, на които бяха изложени плъховете, не бяха постоянни по време на периода на изследване.
Телесното тегло на женските плъхове се е увеличило значително с течение на времето (от 205,2 ± 5,2 g до 213,8 ​​± 7,0 g в контролната група и от 204,0 ± 8,6 g до 211,8 ± 7,5 g в групата, третирана с NaHS); третирането с NaHS обаче не е оказало ефект върху телесното тегло (фиг. 3). Телесното тегло на мъжките плъхове се е увеличило значително с течение на времето (от 338,6 ± 8,3 g до 352,4 ± 6,0 g в контролната група и от 352,4 ± 5,9 g до 363,2 ± 4,3 g в групата, третирана с NaHS); третирането с NaHS обаче не е оказало ефект върху телесното тегло (фиг. 3).
Промени в телесното тегло при женски и мъжки плъхове след прилагане на NaHS (30 μM). Данните са представени като средна стойност ± SEM и са сравнени с помощта на двуфакторен смесен (между-между) дисперсионен анализ с post hoc тест на Bonferroni. n = 5 от всеки пол във всяка група.
Концентрациите на серумна урея и креатин фосфат са сравними при контролните и третираните с NaSH плъхове по време на проучването. Освен това, третирането с NaSH не повлиява серумните концентрации на урея и креатинхром (Таблица 1).
Изходните серумни концентрации на общ сулфид са сравними между контролните и третираните с NaHS мъжки (8,1 ± 0,5 μM спрямо 9,3 ± 0,2 μM) и женски (9,1 ± 1,0 μM спрямо 6,1 ± 1,1 μM) плъхове. Приложението на NaHS в продължение на 14 дни не е оказало влияние върху серумните нива на общ сулфид нито при мъжки, нито при женски плъхове (фиг. 4).
Промени в общите серумни концентрации на сулфид при мъжки и женски плъхове след прилагане на NaHS (30 μM). Данните са представени като средна стойност ± SEM и са сравнени с помощта на двуфакторен смесен (вътрешен-вътрешен) дисперсионен анализ с Bonferroni post hoc тест. Всеки пол, n = 5/група.
Основното заключение на това проучване е, че питейната вода, съдържаща NaHS, е нестабилна: само около една четвърт от първоначалното общо съдържание на сулфиди може да бъде открито 24 часа след вземане на проби от върха и вътрешността на бутилките за вода за плъхове/мишки. Освен това, плъховете са били изложени на нестабилни концентрации на NaHS поради загубата на H2S в разтвора на NaHS, а добавянето на NaHS към питейната вода не е повлияло на телесното тегло, серумната урея и креатин хром, нито на общия серумен сулфид.
В това проучване скоростта на загуба на H2S от 30 μM разтвори на NaHS, приготвени в питейна вода, е била приблизително 3% на час. В буфериран разтвор (100 μM натриев сулфид в 10 mM PBS, pH 7,4), е съобщено, че концентрацията на сулфид намалява със 7% с течение на времето в продължение на 8 часа11. Преди това защитихме интраперитонеалното приложение на NaHS, като съобщихме, че скоростта на загуба на сулфид от 54 μM разтвор на NaHS в питейна вода е била приблизително 2,3% на час (4%/час през първите 12 часа и 1,4%/час през последните 12 часа след приготвянето)8. По-ранни проучвания43 установиха постоянна загуба на H2S от разтвори на NaHS, главно поради изпаряване и окисление. Дори без добавяне на мехурчета, сулфидът в основния разтвор се губи бързо поради изпаряване на H2S11. Проучванията показват, че по време на процеса на разреждане, който отнема около 30–60 секунди, около 5–10% от H2S се губи поради изпаряване6. За да се предотврати изпаряването на H2S от разтвора, изследователите са предприели няколко мерки, включително внимателно разбъркване на разтвора12, покриване на основния разтвор с пластмасово фолио6 и минимизиране на излагането на разтвора на въздух, тъй като скоростта на изпаряване на H2S зависи от границата въздух-течност.13 Спонтанното окисление на H2S се дължи главно на йони на преходни метали, особено на железен (III) оксид, които са примеси във водата.13 Окислението на H2S води до образуването на полисулфиди (серни атоми, свързани чрез ковалентни връзки)11. За да се избегне окислението му, разтвори, съдържащи H2S, се приготвят в деоксигенирани разтворители44,45 и след това се продухват с аргон или азот в продължение на 20–30 минути, за да се осигури деоксигениране.11,12,37,44,45,46 Диетилентриаминпентаоцетната киселина (DTPA) е метален хелатор (10–4 M), който предотвратява автоокислението на HS в аеробни разтвори. При липса на DTPA, скоростта на автоокисление на HS- е приблизително 50% за приблизително 3 часа при 25°C37,47. Освен това, тъй като окислението на 1e-сулфида се катализира от ултравиолетова светлина, разтворът трябва да се съхранява върху лед и да се пази от светлина11.
Както е показано на Фигура 5, NaHS се дисоциира на Na+ и HS-6, когато се разтвори във вода; тази дисоциация се определя от pK1 на реакцията, която зависи от температурата: pK1 = 3.122 + 1132/T, където T варира от 5 до 30°C и се измерва в градуси Келвин (K), K = °C + 273.1548. HS- има високо pK2 (pK2 = 19), така че при pH < 96.49, S2- не се образува или се образува в много малки количества. За разлика от това, HS- действа като основа и приема H+ от молекула H2O, а H2O действа като киселина и се превръща в H2S и OH-.
Образуване на разтворен H2S газ в разтвор на NaHS (30 µM). aq, воден разтвор; g, газ; l, течност. Всички изчисления приемат, че pH на водата = 7,0 и температура на водата = 20 °C. Създадено с BioRender.com.
Въпреки доказателствата, че разтворите на NaHS са нестабилни, няколко проучвания върху животни са използвали разтвори на NaHS в питейна вода като донорно съединение на H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 с продължителност на интервенцията от 1 до 21 седмици (Таблица 2). По време на тези проучвания разтворът на NaHS е бил подновяван на всеки 12 часа, 15, 17, 18, 24, 25 часа или 24 часа, 19, 20, 21, 22, 23 часа. Нашите резултати показват, че плъховете са били изложени на нестабилни концентрации на лекарството поради загубата на H2S от разтвора на NaHS, а съдържанието на NaHS в питейната вода на плъховете се е колебало значително в продължение на 12 или 24 часа (виж Фигура 2). Две от тези проучвания съобщават, че нивата на H2S във водата остават стабилни в продължение на 24 часа22 или че са наблюдавани само 2–3% загуби на H2S в продължение на 12 часа15, но не предоставят подкрепящи данни или подробности за измерванията. Две проучвания показват, че малкият диаметър на бутилките за вода може да минимизира изпарението на H2S15,19. Нашите резултати обаче показват, че това може да забави загубата на H2S от бутилка за вода само с 2 часа, а не с 12–24 часа. И двете проучвания отбелязват, че приемаме, че нивото на NaHS в питейната вода не се е променило, тъй като не наблюдавахме промяна в цвета на водата; следователно окислението на H2S от въздуха не е било значително19,20. Изненадващо, този субективен метод оценява стабилността на NaHS във водата, вместо да измерва промяната в концентрацията му с течение на времето.
Загубата на H2S в разтвор на NaHS е свързана с pH и температурата. Както беше отбелязано в нашето проучване, разтварянето на NaHS във вода води до образуването на алкален разтвор50. Когато NaHS се разтвори във вода, образуването на разтворен H2S газ зависи от стойността на pH6. Колкото по-ниско е pH на разтвора, толкова по-голям е делът на NaHS, присъстващ като молекули H2S газ, и толкова повече сулфид се губи от водния разтвор11. Нито едно от тези проучвания не съобщава за pH на питейната вода, използвана като разтворител за NaHS. Според препоръките на СЗО, които се приемат от повечето страни, pH на питейната вода трябва да бъде в диапазона 6,5–8,551. В този диапазон на pH скоростта на спонтанно окисление на H2S се увеличава приблизително десетократно13. Разтварянето на NaHS във вода в този диапазон на pH ще доведе до концентрация на разтворен H2S газ от 1 до 22,5 μM, което подчертава важността на мониторинга на pH на водата преди разтваряне на NaHS. Освен това, температурният диапазон, докладван в горното проучване (18–26 °C), би довел до промяна в концентрацията на разтворен H2S газ в разтвора с приблизително 10%, тъй като температурните промени променят pK1, а малки промени в pK1 могат да окажат значително влияние върху концентрацията на разтворен H2S газ48. Освен това, дългата продължителност на някои проучвания (5 месеца)22, по време на които се очаква голяма температурна вариабилност, също изостря този проблем.
Всички проучвания с изключение на едно21 използват 30 μM разтвор на NaHS в питейна вода. За да обяснят използваната доза (т.е. 30 μM), някои автори посочват, че NaHS във водната фаза произвежда точно същата концентрация на H2S газ и че физиологичният диапазон на H2S е от 10 до 100 μM, така че тази доза е във физиологичния диапазон15,16. Други обясняват, че 30 μM NaHS може да поддържа плазменото ниво на H2S във физиологичния диапазон, т.е. 5–300 μM19,20. Вземаме предвид концентрацията на NaHS във вода от 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), която е използвана в някои проучвания за изучаване на ефектите на H2S. Можем да изчислим, че концентрацията на разтворен H2S газ е 14,7 μM, което е около 50% от началната концентрация на NaHS. Тази стойност е подобна на стойността, изчислена от други автори при същите условия13,48.
В нашето проучване, приложението на NaHS не промени телесното тегло; този резултат е в съответствие с резултатите от други проучвания при мъжки мишки22,23 и мъжки плъхове18; Две проучвания обаче съобщават, че NaSH възстановява намаленото телесно тегло при нефректомирани плъхове24,26, докато други проучвания не съобщават за ефекта от приложението на NaSH върху телесното тегло15,16,17,19,20,21,25. Освен това, в нашето проучване, приложението на NaSH не повлия на нивата на серумната урея и креатин хром, което е в съответствие с резултатите от друг доклад25.
Проучването установи, че добавянето на NaHS към питейната вода в продължение на 2 седмици не повлиява общите серумни концентрации на сулфид при мъжки и женски плъхове. Това откритие е в съответствие с резултатите на Sen et al. (16): 8 седмици лечение с 30 μM NaHS в питейната вода не повлиява плазмените нива на сулфид при контролните плъхове; те обаче съобщават, че тази интервенция възстановява намалените нива на H2S в плазмата на нефректомирани мишки. Li et al. (22) също съобщават, че лечението с 30 μM NaHS в питейната вода в продължение на 5 месеца повишава плазмените нива на свободен сулфид при възрастни мишки с около 26%. Други проучвания не съобщават за промени в циркулиращия сулфид след добавяне на NaHS към питейната вода.
Седем проучвания съобщават за използване на Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23, но не предоставят допълнителни подробности за хидратационната вода, а пет проучвания не споменават източника на NaHS, използван в методите им за получаване17,18,24,25,26. NaHS е хидратирана молекула и съдържанието на хидратационна вода в нея може да варира, което влияе върху количеството NaHS, необходимо за приготвяне на разтвор с дадена моларност. Например, съдържанието на NaHS в нашето проучване е NaHS•1.3 H2O. Следователно, действителните концентрации на NaHS в тези проучвания може да са по-ниски от докладваните.
„Как е възможно такова краткотрайно съединение да има такъв дълготраен ефект?“ Позгей и др.21 задават този въпрос, когато оценяват ефектите на NaHS върху колит при мишки. Те се надяват, че бъдещите проучвания ще могат да отговорят на този въпрос и предполагат, че разтворите на NaHS може да съдържат по-стабилни полисулфиди в допълнение към H2S и дисулфидите, които медиират ефекта на NaHS21. Друга възможност е, че много ниски концентрации на NaHS, оставащи в разтвора, също могат да имат благоприятен ефект. Всъщност, Олсън и др. предоставят доказателства, че микромоларните нива на H2S в кръвта не са физиологични и трябва да бъдат в наномоларния диапазон или да липсват напълно13. H2S може да действа чрез сулфатиране на протеини, обратима посттранслационна модификация, която влияе върху функцията, стабилността и локализацията на много протеини52,53,54. Всъщност, при физиологични условия, приблизително 10% до 25% от много чернодробни протеини са сулфилирани53. И двете проучвания признават бързото разрушаване на NaHS19,23, но изненадващо заявяват, че „ние контролирахме концентрацията на NaHS в питейната вода, като го замествахме ежедневно“.23 Едно проучване случайно заяви, че „NaHS е стандартен донор на H2S и се използва често в клиничната практика за заместване на самия H2S“.18
Горното обсъждане показва, че NaHS се губи от разтвора чрез изпаряване, окисление и фотолиза и следователно са направени някои предложения за намаляване на загубата на H2S от разтвора. Първо, изпарението на H2S зависи от границата газ-течност13 и pH на разтвора11; следователно, за да се минимизират загубите от изпарение, гърлото на бутилката за вода може да бъде направено възможно най-малко, както е описано по-рано15,19, а pH на водата може да се регулира до приемлива горна граница (т.е. 6,5–8,551), за да се минимизират загубите от изпарение11. Второ, спонтанното окисление на H2S се дължи на въздействието на кислорода и наличието на йони на преходни метали в питейната вода13, така че деоксигенирането на питейната вода с аргон или азот44,45 и използването на метални хелатори37,47 може да намали окислението на сулфидите. Трето, за да се предотврати фоторазлагането на H2S, бутилките за вода могат да бъдат увити с алуминиево фолио; Тази практика се прилага и за светлочувствителни материали като стрептозотоцин55. Накрая, неорганичните сулфидни соли (NaHS, Na2S и CaS) могат да се прилагат чрез сонда, вместо да се разтварят в питейна вода, както е съобщено по-рано56,57,58; проучвания показват, че радиоактивният натриев сулфид, прилаган чрез сонда на плъхове, се абсорбира добре и се разпределя в почти всички тъкани59. Към днешна дата повечето проучвания са прилагали неорганични сулфидни соли интраперитонеално; този път обаче рядко се използва в клинични условия60. От друга страна, пероралният път е най-често срещаният и предпочитан път на приложение при хора61. Следователно, препоръчваме да се оцени ефектът на донорите на H2S при гризачи чрез перорално приложение.
Ограничение е, че ние измервахме сулфид във воден разтвор и серум, използвайки MB метода. Методите за измерване на сулфид включват йодно титруване, спектрофотометрия, електрохимичен метод (потенциометрия, амперометрия, кулометричен метод и амперометричен метод) и хроматография (газова хроматография и високоефективна течна хроматография), сред които най-често използваният метод е MB спектрофотометричният метод62. Ограничение на MB метода за измерване на H2S в биологични проби е, че той измерва всички съдържащи сяра съединения, а не свободния H2S63, тъй като се извършва в киселинни условия, което води до извличане на сяра от биологичния източник64. Според Американската асоциация за обществено здраве обаче, MB е стандартният метод за измерване на сулфид във вода65. Следователно, това ограничение не влияе на основните ни резултати относно нестабилността на разтвори, съдържащи NaHS. Освен това, в нашето проучване, възстановяването на измерванията на сулфид във водни и серумни проби, съдържащи NaHS, е съответно 91% и 93%. Тези стойности са в съответствие с предварително докладвани диапазони (77–92)66, което показва приемлива аналитична прецизност42. Заслужава да се отбележи, че използвахме както мъжки, така и женски плъхове в съответствие с насоките на Националните институти по здравеопазване (NIH), за да избегнем прекомерното разчитане само на проучвания върху мъжки животни в предклиничните проучвания67 и да включим както мъжки, така и женски плъхове, когато е възможно68. Този момент е бил подчертан и от други69,70,71.
В заключение, резултатите от това проучване показват, че разтвори на NaHS, приготвени от питейна вода, не могат да се използват за генериране на H2S поради тяхната нестабилност. Този път на приложение би изложил животните на нестабилни и по-ниски от очакваните нива на NaHS; следователно, резултатите може да не са приложими за хората.
Използваните и/или анализирани по време на настоящото проучване набори от данни са достъпни от съответния автор при разумно искане.
Сабо, К. Хронология на изследванията на сероводорода (H2S): от екологичен токсин до биологичен медиатор. Биохимия и фармакология 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. и Kimura, H. Възможна роля на сероводорода като ендогенен невромодулатор. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. и Papapetropoulos, A. Физиологична роля на сероводорода в клетки, тъкани и органи на бозайници. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Дилън, К. М., Карацоне, Р. Дж., Матсън, Дж. Б. и Кашфи, К. Развиващи се перспективи за клетъчни системи за доставяне на азотен оксид и сероводород: нова ера на персонализираната медицина. Биохимия и фармакология 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X. и др. Дългосрочното приложение на донор на водороден сулфид с бавно освобождаване може да предотврати увреждане от миокардна исхемия/реперфузия. Scientific reports 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Ситдикова, Г. Ф., Фукс, Р., Кайнц, В., Вайгер, Т. М. и Херман, А. Фосфорилирането на BK канала регулира чувствителността към сероводород (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Ситдикова, Г. Ф., Вайгер, Т. М. и Херман, А. Сероводородът усилва активността на калциево-активираните калиеви (BK) канали в туморни клетки на хипофизата на плъхове. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S., et al. Сероводородът усилва защитния ефект на нитритите срещу увреждане от миокардна исхемия-реперфузия при плъхове с диабет тип 2. Nitric Oxide 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A. и др. Тенденции в химията на донорите на H2S и нейното въздействие върху сърдечно-съдовите заболявания. Антиоксиданти 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF и Olson, KR (2012). Пасивни загуби на сероводород в биологични експерименти. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Наги, П. и др. Химични аспекти на измерванията на сероводород във физиологични проби. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Клайн, доктор по право. Спектрофотометрично определяне на сероводород в естествени води. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Олсън, К. Р. (2012). Практическо обучение по химия и биология на сероводорода. „Антиоксиданти.“ Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).