Преди това съобщихме, че серумните нива на чревно-получения триптофанов метаболит индол-3-пропионова киселина (IPA) са по-ниски при пациенти с чернодробна фиброза. В това проучване изследвахме транскриптома и ДНК метилома в черни дробове със затлъстяване във връзка със серумните нива на IPA, както и ролята на IPA в индуцирането на фенотипна инактивация на чернодробни звездовидни клетки (HSCs) in vitro.
Проучването включва 116 пациенти със затлъстяване без захарен диабет тип 2 (T2DM) (възраст 46,8 ± 9,3 години; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²), които са претърпели бариатрична хирургия в Центъра за бариатрична хирургия в Куопио (KOBS). Нивата на циркулиращ IPA са измерени чрез течна хроматография-масспектрометрия (LC-MS), анализът на чернодробните транскриптоми е извършен чрез тотално РНК секвениране, а анализът на ДНК метилирането е извършен с помощта на Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Човешки чернодробни звездовидни клетки (LX-2) са използвани за in vitro експерименти.
Серумните нива на IPA корелират с експресията на гени, участващи в апоптотични, митофагични и дълголетни пътища в черния дроб. Генът AKT серин/треонин киназа 1 (AKT1) е най-разпространеният и доминиращ взаимодействащ ген в профилите на чернодробния транскрипт и ДНК метилиране. Лечението с IPA индуцира апоптоза, намалява митохондриалното дишане и променя клетъчната морфология и митохондриалната динамика чрез модулиране на експресията на гени, за които е известно, че регулират фиброзата, апоптозата и оцеляването на LX-2 клетки.
Взети заедно, тези данни подкрепят тезата, че IPA има потенциални терапевтични ефекти и може да индуцира апоптоза и да измести HSC фенотипа към неактивно състояние, като по този начин разширява възможността за инхибиране на чернодробната фиброза чрез намеса в активирането на HSC и митохондриалния метаболизъм.
Разпространението на затлъстяването и метаболитния синдром се свързва с нарастваща честота на метаболитно свързано мастно чернодробно заболяване (MASLD); заболяването засяга 25% до 30% от общата популация [1]. Основната последица от етиологията на MASLD е чернодробната фиброза, динамичен процес, характеризиращ се с непрекъснато натрупване на фиброзна извънклетъчна матрица (ECM) [2]. Основните клетки, участващи в чернодробната фиброза, са чернодробните звездовидни клетки (HSCs), които проявяват четири известни фенотипа: неподвижни, активирани, инактивирани и стареещи [3, 4]. HSCs могат да бъдат активирани и трансдиференцирани от неподвижна форма в пролиферативни фибробластоподобни клетки с високи енергийни нужди, с повишена експресия на α-гладкомускулен актин (α-SMA) и колаген тип I (Col-I) [5, 6]. По време на обръщането на чернодробната фиброза, активираните HSCs се елиминират чрез апоптоза или инактивиране. Тези процеси включват понижаване на фиброгенните гени и модулация на про-оцелителни гени (като сигналните пътища на NF-κB и PI3K/Akt) [7, 8], както и промени в динамиката и функцията на митохондриите [9].
Серумните нива на триптофановия метаболит индол-3-пропионова киселина (IPA), произвеждан в червата, са намалени при метаболитни заболявания при хора, включително MASLD [10–13]. IPA е свързан с приема на диетични фибри, известен е със своите антиоксидантни и противовъзпалителни ефекти и отслабва фенотипа на индуцирания от диетата неалкохолен стеатохепатит (NASH) in vivo и in vitro [11–14]. Някои доказателства идват от нашето предишно проучване, което показа, че серумните нива на IPA са по-ниски при пациенти с чернодробна фиброза, отколкото при пациенти със затлъстяване без чернодробна фиброза в проучването Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Освен това, ние показахме, че лечението с IPA може да намали експресията на гени, които са класически маркери на клетъчната адхезия, клетъчната миграция и активирането на хематопоетичните стволови клетки в модел на човешки чернодробни звездовидни клетки (LX-2) и е потенциален хепатопротективен метаболит [15]. Въпреки това, остава неясно как IPA индуцира регресия на чернодробната фиброза чрез активиране на апоптозата на HSC и митохондриалната биоенергетика.
Тук ние демонстрираме, че серумният IPA е свързан с експресията на гени, обогатени с пътища на апоптоза, митофагия и дълголетие в черния дроб на индивиди със затлъстяване, но без диабет тип 2 (KOBS). Освен това, открихме, че IPA може да индуцира клирънса и разграждането на активирани хематопоетични стволови клетки (HSCs) чрез пътя на инактивиране. Тези резултати разкриват нова роля на IPA, което го прави потенциална терапевтична цел за насърчаване на регресия на чернодробната фиброза.
Предишно проучване в кохортата KOBS показа, че пациенти с чернодробна фиброза имат по-ниски нива на IPA в кръвта в сравнение с пациенти без чернодробна фиброза [15]. За да изключим потенциалния объркващ ефект на диабет тип 2, ние включихме 116 пациенти със затлъстяване без диабет тип 2 (средна възраст ± SD: 46,8 ± 9,3 години; ИТМ: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Таблица 1) от текущото проучване KOBS като изследвана популация [16]. Всички участници дадоха писмено информирано съгласие и протоколът на изследването беше одобрен от Етичната комисия на болницата в окръг Северно Саво в съответствие с Декларацията от Хелзинки (54/2005, 104/2008 и 27/2010).
Проби от чернодробна биопсия са получени по време на бариатрична хирургия и хистологично оценени от опитни патолози съгласно предварително описани критерии [17, 18]. Критериите за оценка са обобщени в Допълнителна таблица S1 и са описани по-рано [19].
Пробите от серума на гладно бяха анализирани чрез нетаргетна течна хроматография-масспектрометрия (LC-MS) за метаболомен анализ (n = 116). Пробите бяха анализирани с помощта на UHPLC-qTOF-MS система (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Германия), както е описано по-рано19. Идентифицирането на изопропиловия алкохол (IPA) се основаваше на времето на задържане и сравнение на MS/MS спектъра с чисти стандарти. Интензитетът на IPA сигнала (площта на пика) беше взет предвид във всички по-нататъшни анализи [20].
Секвенирането на цялата чернодробна РНК беше извършено с помощта на Illumina HiSeq 2500, а данните бяха предварително обработени, както е описано по-рано [19, 21, 22]. Извършихме целенасочен диференциален експресионен анализ на транскрипти, засягащи митохондриалната функция/биогенеза, използвайки 1957 гена, избрани от базата данни MitoMiner 4.0 [23]. Анализът на метилирането на чернодробна ДНК беше извършен с помощта на Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ), използвайки същата методология, както е описано по-рано [24, 25].
Човешки чернодробни звездовидни клетки (LX-2) бяха любезно предоставени от проф. Стефано Ромео и бяха култивирани и поддържани в DMEM/F12 среда (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). За да се избере работната доза IPA, LX-2 клетките бяха третирани с различни концентрации на IPA (10 μM, 100 μM и 1 mM; Sigma, 220027) в DMEM/F12 среда в продължение на 24 часа. Освен това, за да се изследва способността на IPA да инактивира HSCs, LX-2 клетките бяха едновременно третирани с 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) и 1 mM IPA в безсерумна среда в продължение на 24 часа. За съответните контролни носители, 4 nM HCL, съдържаща 0.1% BSA, е използвана за третиране с TGF-β1, а 0.05% DMSO е използвана за третиране с IPA, като и двете са използвани заедно за комбинираното третиране.
Апоптозата беше оценена с помощта на FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit със 7-AAD (Biolegend, Сан Диего, Калифорния, САЩ, Cat# 640922) съгласно инструкциите на производителя. Накратко, LX-2 (1 × 105 клетки/ямка) бяха култивирани за една нощ в 12-ямкови плаки и след това третирани с множество дози IPA или IPA и TGF-β1. На следващия ден, плаващите и адхезивните клетки бяха събрани, трипсинизирани, промити с PBS, ресуспендирани в буфер за свързване на Annexin V и инкубирани с FITC-Annexin V и 7-AAD за 15 минути.
Митохондриите в живите клетки бяха оцветени за оксидативна активност, използвайки Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорния). За MTR анализите, LX-2 клетките бяха инкубирани при равни плътности с IPA и TGF-β1. След 24 часа, живите клетки бяха трипсинизирани, промити с PBS и след това инкубирани със 100 μM MTR в безсерумна среда при 37°C за 20 минути, както е описано по-рано [26]. За анализ на морфологията на живите клетки, размерът на клетките и цитоплазмената сложност бяха анализирани съответно с помощта на параметри за директно разсейване (FSC) и странично разсейване (SSC).
Всички данни (30 000 събития) бяха получени с помощта на NovoCyte Quanteon (Agilent) и анализирани с помощта на софтуера NovoExpress® 1.4.1 или FlowJo V.10.
Скоростта на консумация на кислород (OCR) и скоростта на извънклетъчно подкиселяване (ECAR) бяха измерени в реално време с помощта на Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния), оборудван със Seahorse XF Cell Mito Stress, съгласно инструкциите на производителя. Накратко, 2 × 104 LX-2 клетки/ямка бяха посяти върху XF96 клетъчни културални плаки. След инкубация за една нощ, клетките бяха третирани с изопропанол (IPA) и TGF-β1 (Допълнителни методи 1). Анализът на данните беше извършен с помощта на софтуера Seahorse XF Wave, който включва Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. От това беше изчислен индекс на биоенергийно здраве (BHI) [27].
Тоталната РНК беше транскрибирана в кДНК. За специфични методи вижте референцията [15]. Нивата на мРНК на човешки 60S рибозомен киселинен протеин P0 (RPLP0) и циклофилин А1 (PPIA) бяха използвани като конститутивни генни контроли. Използвана беше QuantStudio 6 pro Real-Time PCR система (Thermo Fisher, Landsmeer, Холандия) с TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) или Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), а относителната честота на генната експресия беше изчислена с помощта на сравнителни параметри на циклиране на Ct стойности (ΔΔCt) и метода ∆∆Ct. Подробности за праймерите са предоставени в допълнителни таблици S2 и S3.
Ядрена ДНК (ncDNA) и митохондриална ДНК (mtDNA) бяха екстрахирани с помощта на DNeasy blood and tissue kit (Qiagen), както е описано по-рано [28]. Относителното количество mtDNA беше изчислено чрез изчисляване на съотношението на всеки целеви mtDNA регион към средната геометрична стойност на трите ядрени ДНК региона (mtDNA/ncDNA), както е описано подробно в Допълнителни методи 2. Подробности за праймерите за mtDNA и ncDNA са предоставени в Допълнителна таблица S4.
Живи клетки бяха оцветени с Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорния) за визуализиране на междуклетъчните и вътреклетъчните митохондриални мрежи. LX-2 клетки (1 × 104 клетки/ямка) бяха култивирани върху стъклени слайдове в съответните културални плаки със стъклено дъно (Ibidi GmbH, Martinsried, Германия). След 24 часа, живите LX-2 клетки бяха инкубирани със 100 μM MTR за 20 минути при 37 °C и клетъчните ядра бяха оцветени с DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich), както е описано по-рано [29]. Митохондриалните мрежи бяха визуализирани с помощта на инвертен микроскоп Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Йена, Германия), оборудван с конфокален модул Zeiss LSM 800 при 37 °C във влажна атмосфера с 5% CO2, използвайки обектив 63×NA 1.3. Получихме десет изображения от Z-серия за всеки тип проба. Всяка Z-серия съдържа 30 секции, всяка с дебелина 9,86 μm. За всяка проба са получени изображения на десет различни зрителни полета с помощта на софтуера ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Йена, Германия), а анализът на митохондриалната морфология е извършен с помощта на софтуера ImageJ (v1.54d) [30, 31] съгласно параметрите, описани подробно в Допълнителни методи 3.
Клетките бяха фиксирани с 2% глутаралдехид в 0.1 М фосфатен буфер, последвано от фиксиране с 1% разтвор на осмиев тетроксид (Sigma Aldrich, MO, САЩ), постепенно дехидратирани с ацетон (Merck, Darmstadt, Германия) и накрая вградени в епоксидна смола. Приготвени бяха ултратънки срези и оцветени с 1% уранил ацетат (Merck, Darmstadt, Германия) и 1% оловен цитрат (Merck, Darmstadt, Германия). Ултраструктурните изображения бяха получени с помощта на трансмисионен електронен микроскоп JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Токио, Япония) при ускоряващо напрежение 80 kV.
Морфологията на LX-2 клетки, третирани с IPA в продължение на 24 часа, беше анализирана чрез фазово-контрастна микроскопия при 50x увеличение, използвайки инвертен светлинен микроскоп Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 и AxioCam MRm, Йена, Германия).
Клиничните данни бяха изразени като средна стойност ± стандартно отклонение или медиана (интерквартилен диапазон: IQR). За сравняване на разликите между трите изследвани групи беше използван еднофакторен дисперсионен анализ (непрекъснати променливи) или χ² тест (категорични променливи). За коригиране на многократното тестване беше използван процентът на фалшиво положителни резултати (FDR), а гените с FDR < 0,05 бяха считани за статистически значими. За корелация на CpG ДНК метилирането с интензитета на IPA сигнала беше използван корелационен анализ на Spearman, като бяха отчетени номинални p стойности (p < 0,05).
Анализът на генния път беше извършен с помощта на уеб-базиран инструмент за анализ на генни набори (WebGestalt) за 268 транскрипта (номинално p < 0,01), 119 транскрипта, свързани с митохондрии (номинално p < 0,05) и 4350 CpG от 3093 чернодробни транскрипта, които бяха свързани с нивата на циркулиращия серумен IPA. Свободно достъпният инструмент Venny DB (версия 2.1.0) беше използван за намиране на припокриващи се гени, а StringDB (версия 11.5) беше използван за визуализиране на протеин-протеинови взаимодействия.
За експеримента LX-2, пробите бяха тествани за нормалност, използвайки теста на D'Agostino-Pearson. Данните бяха получени от поне три биологични повторения и подложени на еднофакторен ANOVA с post hoc тест на Bonferroni. p-стойност по-малка от 0,05 се считаше за статистически значима. Данните са представени като средна стойност ± SD, а броят на експериментите е посочен във всяка фигура. Всички анализи и графики бяха извършени с помощта на статистическия софтуер GraphPad Prism 8 за Windows (GraphPad Software Inc., версия 8.4.3, Сан Диего, САЩ).
Първо, изследвахме връзката на серумните нива на IPA с чернодробните, телесните и митохондриалните транскрипти. В общия транскриптен профил, най-силно асоциираният ген със серумните нива на IPA беше MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; митоген-активирана протеин киназа-активирана протеин киназа 3); в профила на транскриптите, свързани с митохондриите, най-силно асоциираният ген беше AKT1 (FDR = 0.7621; AKT серин/треонин киназа 1) (Допълнителен файл 1 и Допълнителен файл 2).
След това анализирахме глобални транскрипти (n = 268; p < 0,01) и транскрипти, свързани с митохондриите (n = 119; p < 0,05), като в крайна сметка идентифицирахме апоптозата като най-значимия каноничен път (p = 0,0089). За митохондриалните транскрипти, свързани със серумните нива на IPA, се фокусирахме върху апоптозата (FDR = 0,00001), митофагията (FDR = 0,00029) и TNF сигналните пътища (FDR = 0,000006) (Фигура 1А, Таблица 2 и Допълнителни фигури 1А-Б).
Припокриващ се анализ на глобални, митохондриално-асоциирани транскрипти и ДНК метилиране в човешки черен дроб във връзка със серумните нива на IPA. A представлява 268 глобални транскрипта, 119 митохондриално-асоциирани транскрипта и ДНК метилирани транскрипта, които са картографирани към 3092 CpG места, свързани със серумните нива на IPA (p стойности < 0,01 за глобални транскрипти и ДНК метилирани и p стойности < 0,05 за митохондриални транскрипти). Основните припокриващи се транскрипти са показани в средата (AKT1 и YKT6). B Картата на взаимодействието на 13-те гена с най-висок резултат за взаимодействие (0,900) с други гени е конструирана от 56-те припокриващи се гена (черна линия), които са значително свързани със серумните нива на IPA, използвайки онлайн инструмента StringDB. Зелено: Гени, картографирани към клетъчния компонент на Gene Ontology (GO): митохондрии (GO:0005739). AKT1 е протеинът с най-висок резултат (0.900) за взаимодействия с други протеини, базирани на данните (базирани на текстов анализ, експерименти, бази данни и коекспресия). Мрежовите възли представляват протеини, а ръбовете представляват връзки между протеини.
Тъй като метаболитите на чревната микробиота могат да регулират епигенетичния състав чрез ДНК метилиране [32], ние изследвахме дали серумните нива на IPA са свързани с метилирането на чернодробната ДНК. Установихме, че двата основни места на метилиране, свързани със серумните нива на IPA, са близо до богатия на пролин-серин регион 3 (C19orf55) и член 6 от семейството B на протеините на топлинния шок (малък) (HSPB6) (Допълнителен файл 3). ДНК метилирането на 4350 CpG (p < 0,01) корелира със серумните нива на IPA и е обогатено с регулаторни пътища за дълголетие (p = 0,006) (Фигура 1А, Таблица 2 и Допълнителна Фигура 1C).
За да разберем биологичните механизми, лежащи в основата на връзките между серумните нива на IPA, глобалните транскрипти, транскриптите, свързани с митохондриите, и ДНК метилирането в човешкия черен дроб, извършихме анализ на припокриването на гените, идентифицирани в предишния анализ на пътищата (Фигура 1А). Резултатите от анализа за обогатяване на пътищата на 56-те припокриващи се гена (вътре в черната линия на Фигура 1А) показаха, че пътят на апоптоза (p = 0,00029) откроява два гена, общи за трите анализа: AKT1 и YKT6 (YKT6 v-SNARE хомолог), както е показано на диаграмата на Вен (Допълнителна Фигура 2 и Фигура 1А). Интересното е, че открихме, че AKT1 (cg19831386) и YKT6 (cg24161647) са положително корелирани със серумните нива на IPA (Допълнителен файл 3). За да идентифицираме потенциални протеинови взаимодействия между генните продукти, избрахме 13 гена с най-висок общ регионен резултат (0,900) сред 56 припокриващи се гена като входни данни и конструирахме карта на взаимодействията. Според нивото на доверие (пределна увереност), генът AKT1 с най-висок резултат (0,900) е на върха (Фигура 1B).
Въз основа на анализа на пътищата, установихме, че апоптозата е основният път, така че изследвахме дали лечението с IPA би повлияло на апоптозата на HSCs in vitro. Преди това демонстрирахме, че различни дози IPA (10 μM, 100 μM и 1 mM) са нетоксични за LX-2 клетки [15]. Това проучване показа, че третирането с IPA с 10 μM и 100 μM увеличава броя на жизнеспособните и некротичните клетки. Въпреки това, в сравнение с контролната група, клетъчната жизнеспособност намалява при концентрация на 1 mM IPA, докато скоростта на клетъчна некроза остава непроменена (Фигура 2A, B). След това, за да намерим оптималната концентрация за индуциране на апоптоза в LX-2 клетки, тествахме 10 μM, 100 μM и 1 mM IPA в продължение на 24 часа (Фигура 2A-E и Допълнителна Фигура 3A-B). Интересно е, че IPA 10 μM и 100 μM намаляват степента на апоптоза (%), но IPA 1 mM увеличава късната апоптоза и степента на апоптоза (%) в сравнение с контролата и следователно е избран за по-нататъшни експерименти (Фигури 2A-D).
IPA индуцира апоптоза на LX-2 клетки. Методът на двойно оцветяване с Анексин V и 7-AAD е използван за количествено определяне на скоростта на апоптоза и клетъчната морфология чрез флоуцитометрия. BA клетките са инкубирани с 10 μM, 100 μM и 1 mM IPA за 24 часа или с F–H TGF-β1 (5 ng/ml) и 1 mM IPA в безсерумна среда за 24 часа. A: живи клетки (Анексин V -/ 7AAD-); B: некротични клетки (Анексин V -/ 7AAD+); C, F: ранни (Анексин V +/ 7AAD-); D, G: късни (Анексин V+/7AAD.+); E, H: процент от общия брой ранни и късни апоптотични клетки в скоростта на апоптоза (%). Данните са изразени като средна стойност ± SD, n = 3 независими експеримента. Статистическите сравнения са извършени с помощта на еднофакторен ANOVA с Bonferroni post hoc тест. *p < 0.05; ****p < 0,0001
Както показахме по-рано, 5 ng/ml TGF-β1 може да индуцира активиране на HSC чрез увеличаване на експресията на класически маркерни гени [15]. LX-2 клетки бяха третирани с 5 ng/ml TGF-β1 и 1 mM IPA в комбинация (Фиг. 2E–H). Лечението с TGF-β1 не промени скоростта на апоптоза, но едновременното лечение с IPA увеличи късната апоптоза и скоростта на апоптоза (%) в сравнение с лечението с TGF-β1 (Фиг. 2E–H). Тези резултати показват, че 1 mM IPA може да стимулира апоптозата в LX-2 клетки, независимо от индуцирането на TGF-β1.
Допълнително изследвахме ефекта на IPA върху митохондриалното дишане в LX-2 клетки. Резултатите показаха, че 1 mM IPA намалява параметрите на консумация на кислород (OCR): немитохондриално дишане, базално и максимално дишане, изтичане на протони и производство на АТФ в сравнение с контролната група (Фигура 3А, Б), докато индексът на биоенергийно здраве (BHI) не се променя.
IPA намалява митохондриалното дишане в LX-2 клетки. Кривата на митохондриалното дишане (OCR) е представена като параметри на митохондриалното дишане (немитохондриално дишане, базално дишане, максимално дишане, изтичане на протони, генериране на АТФ, SRC и BHI). Клетки A и B са инкубирани съответно с 10 μM, 100 μM и 1 mM IPA за 24 часа. Клетки C и D са инкубирани съответно с TGF-β1 (5 ng/ml) и 1 mM IPA в безсерумна среда за 24 часа. Всички измервания са нормализирани спрямо съдържанието на ДНК, използвайки CyQuant kit. BHI: биоенергиен индекс на здраве; SRC: дихателен резервен капацитет; OCR: скорост на консумация на кислород. Данните са представени като средна стойност ± стандартно отклонение (SD), n = 5 независими експеримента. Статистическите сравнения са извършени с помощта на еднофакторен ANOVA и Bonferroni post hoc тест. *p < 0.05; **p < 0.01; и ***p < 0.001
За да получим по-цялостно разбиране на ефекта на IPA върху биоенергийния профил на TGF-β1-активирани LX-2 клетки, анализирахме митохондриалното окислително фосфорилиране чрез OCR (фиг. 3C,D). Резултатите показаха, че третирането с TGF-β1 може да намали максималното дишане, дихателния резервен капацитет (SRC) и BHI в сравнение с контролната група (фиг. 3C,D). Освен това, комбинираното лечение намали базалното дишане, изтичането на протони и производството на АТФ, но SRC и BHI бяха значително по-високи от тези, третирани с TGF-β1 (фиг. 3C,D).
Проведохме и „Тест за клетъчен енергиен фенотип“, предоставен от софтуера Seahorse (Допълнителна фигура 4A–D). Както е показано на Допълнителна фигура 3B, метаболитните потенциали както на OCR, така и на ECAR бяха намалени след лечение с TGF-β1, но не се наблюдаваше разлика в групите с комбинирано лечение и лечение с IPA в сравнение с контролната група. Освен това, както базалните, така и нивата на стрес на OCR бяха намалени след комбинирано лечение и лечение с IPA в сравнение с контролната група (Допълнителна фигура 4C). Интересно е, че подобен модел се наблюдава при комбинирана терапия, където не се наблюдава промяна в базалните и нивата на стрес на ECAR в сравнение с лечението с TGF-β1 (Допълнителна фигура 4C). В HSCs, намаляването на митохондриалното окислително фосфорилиране и способността на комбинираното лечение да възстанови SCR и BHI след излагане на лечение с TGF-β1 не промениха метаболитния потенциал (OCR и ECAR). Взети заедно, тези резултати показват, че IPA може да намали биоенергетиката в HSCs, което предполага, че IPA може да индуцира по-нисък енергиен профил, който измества фенотипа на HSC към инактивиране (Допълнителна фигура 4D).
Ефектът на IPA върху динамиката на митохондриите е изследван с помощта на триизмерно количествено определяне на митохондриалната морфология и мрежовите връзки, както и MTR оцветяване (Фигура 4 и Допълнителна Фигура 5). Фигура 4 показва, че в сравнение с контролната група, третирането с TGF-β1 е намалило средната повърхност, броя на разклоненията, общата дължина на разклоненията и броя на връзките на разклоненията (Фигура 4А и B) и е променило дела на митохондриите от сферична към междинна морфология (Фигура 4C). Само третирането с IPA е намалило средния обем на митохондриите и е променило дела на митохондриите от сферична към междинна морфология в сравнение с контролната група (Фигура 4А). За разлика от това, сферичността, средната дължина на разклоненията и митохондриалната активност, оценени чрез MTR, зависим от потенциала на митохондриалната мембрана (Фигура 4А и E), са останали непроменени и тези параметри не са се различавали между групите. Взети заедно, тези резултати показват, че третирането с TGF-β1 и IPA изглежда модулира формата и размера на митохондриите, както и сложността на мрежата в живите LX-2 клетки.
IPA променя митохондриалната динамика и изобилието на митохондриална ДНК в LX-2 клетки. A. Представителни конфокални изображения на живи LX-2 клетки, инкубирани с TGF-β1 (5 ng/ml) и 1 mM IPA за 24 часа в безсерумна среда, показващи митохондриални мрежи, оцветени с Mitotracker™ Red CMXRos, и ядра, оцветени в синьо с DAPI. Всички данни съдържат поне 15 изображения на група. Получихме 10 Z-stack изображения за всеки тип проба. Всяка Z-ос последователност съдържаше 30 среза, всеки с дебелина 9,86 μm. Мащабна лента: 10 μm. B. Представителни обекти (само митохондрии), идентифицирани чрез прилагане на адаптивно прагиране към изображението. Количествен анализ и сравнение на митохондриалните морфологични мрежови връзки бяха извършени за всички клетки във всяка група. C. Честота на съотношенията на митохондриалната форма. Стойности, близки до 0, показват сферични форми, а стойности, близки до 1, показват нишковидни форми. D Съдържанието на митохондриална ДНК (mtDNA) беше определено, както е описано в Материали и методи. Анализът с E Mitotracker™ Red CMXRos беше извършен чрез флуоцитометрия (30 000 събития), както е описано в Материали и методи. Данните са представени като средна стойност ± SD, n = 3 независими експеримента. Статистическите сравнения бяха извършени с помощта на еднофакторен ANOVA и Bonferroni post hoc тест. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
След това анализирахме съдържанието на mtDNA в LX-2 клетки като индикатор за броя на митохондриите. В сравнение с контролната група, съдържанието на mtDNA беше повишено в групата, третирана с TGF-β1 (Фигура 4D). В сравнение с групата, третирана с TGF-β1, съдържанието на mtDNA беше намалено в групата с комбинирано лечение (Фигура 4D), което предполага, че IPA може да намали съдържанието на mtDNA и евентуално броя на митохондриите, както и митохондриалното дишане (Фигура 3C). Освен това, IPA изглежда намалява съдържанието на mtDNA при комбинираното лечение, но не повлиява MTR-медиираната митохондриална активност (Фигури 4A-C).
Изследвахме връзката на IPA с нивата на mRNA на гени, свързани с фиброза, апоптоза, преживяемост и митохондриална динамика в LX-2 клетки (Фигура 5A–D). В сравнение с контролната група, групата, третирана с TGF-β1, показа повишена експресия на гени като колаген тип I α2 верига (COL1A2), α-гладкомускулен актин (αSMA), матриксна металопротеиназа 2 (MMP2), тъканен инхибитор на металопротеиназа 1 (TIMP1) и ген, подобен на динамин 1 (DRP1), което показва повишена фиброза и активиране. Освен това, в сравнение с контролната група, лечението с TGF-β1 намали нивата на mRNA на ядрения прегнан X рецептор (PXR), каспаза 8 (CASP8), MAPKAPK3, инхибитор на B-клетките α, енхансер на лекия пептид на гена на ядрения фактор κ (NFκB1A) и инхибитор на субединицата β на киназата на ядрения фактор κB (IKBKB) (Фигура 5A–D). В сравнение с лечението с TGF-β1, комбинираното лечение с TGF-β1 и IPA намалява експресията на COL1A2 и MMP2, но повишава нивата на mRNA на PXR, TIMP1, B-клетъчен лимфом-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β и IKBKB. IPA лечението значително намалява експресията на MMP2, Bcl-2-асоцииран протеин X (BAX), AKT1, протеин на оптична атрофия 1 (OPA1) и митохондриален фузионен протеин 2 (MFN2), докато експресията на CASP8, NFκB1A, NFκB1B и IKBKB е повишена в сравнение с контролната група. Не е установена обаче разлика в експресията на каспаза-3 (CASP3), фактор 1, активиращ апоптотична пептидаза (APAF1), митохондриален фузионен протеин 1 (MFN1) и протеин на делене 1 (FIS1). Взети заедно, тези резултати показват, че лечението с IPA модулира експресията на гени, свързани с фиброза, апоптоза, оцеляване и митохондриална динамика. Нашите данни показват, че лечението с IPA намалява фиброзата в LX-2 клетки; в същото време то стимулира оцеляването чрез изместване на фенотипа към инактивиране.
IPA модулира експресията на фибробластни, апоптотични, жизнеспособни и митохондриални динамикни гени в LX-2 клетки. Хистограмите показват експресията на mRNA спрямо ендогенния контрол (RPLP0 или PPIA), след като LX-2 клетките са индуцирани с TGF-β1 и IPA в безсерумна среда в продължение на 24 часа. A показва фибробласти, B показва апоптотични клетки, C показва оцелели клетки и D показва генната експресия на митохондриалната динамика. Данните са представени като средна стойност ± стандартно отклонение (SD), n = 3 независими експеримента. Статистическите сравнения са извършени с помощта на еднофакторен ANOVA и Bonferroni post hoc тест. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
След това, промените в размера на клетките (FSC-H) и цитоплазмената сложност (SSC-H) бяха оценени чрез флоуцитометрия (Фигура 6A,B), а промените в клетъчната морфология след третиране с IPA бяха оценени чрез трансмисионна електронна микроскопия (TEM) и фазово-контрастна микроскопия (Допълнителна Фигура 6A-B). Както се очакваше, клетките в групата, третирана с TGF-β1, се увеличиха по размер в сравнение с контролната група (Фигура 6A,B), показвайки класическото разширяване на грапавия ендоплазмен ретикулум (ER*) и фаголизозомите (P), което показва активиране на хематопоетичните стволови клетки (HSC) (Допълнителна Фигура 6A). Въпреки това, в сравнение с групата, третирана с TGF-β1, размерът на клетките, цитоплазмената сложност (Фиг. 6A,B) и съдържанието на ER* бяха намалени в групата, третирана с комбинирано лечение с TGF-β1 и IPA (Допълнителна Фиг. 6A). Освен това, третирането с IPA намали размера на клетките, цитоплазмената сложност (Фиг. 6A,B), съдържанието на P и ER* (Допълнителна Фиг. 6A) в сравнение с контролната група. Освен това, съдържанието на апоптотични клетки се е увеличило след 24 часа третиране с IPA в сравнение с контролната група (бели стрелки, допълнителна фигура 6B). Взети заедно, тези резултати показват, че 1 mM IPA може да стимулира апоптозата на HSC и да обърне промените в клетъчните морфологични параметри, индуцирани от TGF-β1, като по този начин регулира размера и сложността на клетките, което може да е свързано с инактивиране на HSC.
IPA променя размера на клетките и цитоплазмената сложност в LX-2 клетки. Представителни изображения на анализ с флоуцитометрия. Анализът използва стратегия за гейтинг, специфична за LX-2 клетки: SSC-A/FSC-A за дефиниране на клетъчната популация, FSC-H/FSC-A за идентифициране на дублети и SSC-H/FSC-H за анализ на размера и сложността на клетките. Клетките бяха инкубирани с TGF-β1 (5 ng/ml) и 1 mM IPA в безсерумна среда за 24 часа. LX-2 клетките бяха разпределени в долен ляв квадрант (SSC-H-/FSC-H-), горен ляв квадрант (SSC-H+/FSC-H-), долен десен квадрант (SSC-H-/FSC-H+) и горен десен квадрант (SSC-H+/FSC-H+) за анализ на размера на клетките и цитоплазмената сложност. Б. Клетъчната морфология е анализирана чрез флуоцитометрия, използвайки FSC-H (директно разсейване, размер на клетката) и SSC-H (странично разсейване, цитоплазмена сложност) (30 000 събития). Данните са представени като средна стойност ± SD, n = 3 независими експеримента. Статистическите сравнения са извършени с помощта на еднофакторен ANOVA и Bonferroni post hoc тест. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 и ****p < 0,0001
Чревните метаболити, като IPA, са се превърнали в гореща тема на изследвания, което предполага, че могат да бъдат открити нови мишени в чревната микробиота. Следователно е интересно, че IPA, метаболит, който свързваме с чернодробната фиброза при хора [15], е доказано потенциално антифиброзно съединение в животински модели [13, 14]. Тук за първи път демонстрираме връзка между серумния IPA и глобалната чернодробна транскриптомика и ДНК метилирането при затлъстели индивиди без диабет тип 2 (T2D), като подчертаваме апоптозата, митофагията и дълголетието, както и възможен кандидат ген AKT1, регулиращ чернодробната хомеостаза. Друга новост на нашето проучване е, че демонстрирахме взаимодействието на лечението с IPA с апоптозата, клетъчната морфология, митохондриалната биоенергетика и динамика в LX-2 клетки, което показва по-нисък енергиен спектър, който измества HSC фенотипа към инактивиране, което прави IPA потенциален кандидат за подобряване на чернодробната фиброза.
Установихме, че апоптозата, митофагията и дълголетието са най-важните канонични пътища, обогатени с чернодробни гени, свързани с циркулиращия серумен IPA. Нарушаването на системата за контрол на качеството на митохондриите (MQC) може да доведе до митохондриална дисфункция, митофагия и апоптоза, като по този начин насърчава появата на MASLD [33, 34]. Следователно можем да предположим, че IPA може да участва в поддържането на клетъчната динамика и митохондриалната цялост чрез апоптоза, митофагия и дълголетие в черния дроб. Нашите данни показват, че два гена са общи в трите анализа: YKT6 и AKT1. Заслужава да се отбележи, че YKT6 е SNARE протеин, участващ в процеса на сливане на клетъчната мембрана. Той играе роля в автофагията и митофагията, като образува инициационен комплекс със STX17 и SNAP29 върху автофагозомата, като по този начин насърчава сливането на автофагозоми и лизозоми [35]. Освен това, загубата на YKT6 функция води до нарушена митофагия [36], докато повишената регулация на YKT6 е свързана с прогресията на хепатоцелуларен карцином (HCC), показвайки повишена клетъчна преживяемост [37]. От друга страна, AKT1 е най-важният взаимодействащ ген и играе важна роля в чернодробните заболявания, включително сигналния път PI3K/AKT, клетъчния цикъл, клетъчната миграция, пролиферацията, фокалната адхезия, митохондриалната функция и секрецията на колаген [38–40]. Активираният сигнален път PI3K/AKT може да активира хематопоетични стволови клетки (HSCs), които са клетките, отговорни за производството на извънклетъчен матрикс (ECM), и неговата дисрегулация може да допринесе за появата и прогресията на чернодробната фиброза [40]. Освен това, AKT е един от ключовите фактори за оцеляване на клетките, който инхибира p53-зависимата клетъчна апоптоза, а активирането на AKT може да е свързано с инхибирането на апоптозата на чернодробните клетки [41, 42]. Получените резултати показват, че IPA може да участва в апоптозата, свързана с чернодробните митохондрии, като повлиява решението на хепатоцитите между навлизане в апоптоза или оцеляване. Тези ефекти могат да бъдат регулирани от кандидат-гени AKT и/или YKT6, които са критични за чернодробната хомеостаза.
Нашите резултати показват, че 1 mM IPA индуцира апоптоза и намалява митохондриалното дишане в LX-2 клетки, независимо от третирането с TGF-β1. Прави впечатление, че апоптозата е основен път за разрешаване на фиброзата и активиране на хематопоетичните стволови клетки (HSC), а също така е ключово събитие в обратимия физиологичен отговор на чернодробната фиброза [4, 43]. Освен това, възстановяването на BHI в LX-2 клетки след комбинирано лечение предоставя нови прозрения за потенциалната роля на IPA в регулирането на митохондриалната биоенергетика. В условия на покой и неактивност, хематопоетичните клетки обикновено използват митохондриално окислително фосфорилиране, за да произвеждат АТФ и имат ниска метаболитна активност. От друга страна, активирането на HSC усилва митохондриалното дишане и биосинтеза, за да компенсира енергийните нужди от навлизане в гликолитично състояние [44]. Фактът, че IPA не повлиява метаболитния потенциал и ECAR, предполага, че гликолитичният път е по-малко приоритетен. По подобен начин, друго проучване показва, че 1 mM IPA е в състояние да модулира активността на митохондриалната дихателна верига в кардиомиоцити, човешка хепатоцитна клетъчна линия (Huh7) и ендотелни клетки от човешка пъпна вена (HUVEC); Въпреки това, не е открит ефект на IPA върху гликолизата в кардиомиоцитите, което предполага, че IPA може да повлияе на биоенергетиката на други клетъчни типове [45]. Следователно, предполагаме, че 1 mM IPA може да действа като лек химичен разединител, тъй като може значително да намали фиброгенната генна експресия, клетъчната морфология и митохондриалната биоенергетика, без да променя количеството на mtDNA [46]. Митохондриалните разединители могат да инхибират индуцираната от културата фиброза и активирането на HSC [47] и да намалят производството на митохондриален АТФ, регулирано или индуцирано от определени протеини, като разединяващи протеини (UCP) или аденин нуклеотидна транслоказа (ANT). В зависимост от клетъчния тип, това явление може да предпази клетките от апоптоза и/или да насърчи апоптозата [46]. Необходими са обаче допълнителни изследвания, за да се изясни ролята на IPA като митохондриален разединител при инактивирането на хемопоетичните стволови клетки.
След това изследвахме дали промените в митохондриалното дишане се отразяват в митохондриалната морфология в живите LX-2 клетки. Интересно е, че третирането с TGF-β1 променя пропорцията на митохондриите от сферична към междинна, с намалено митохондриално разклоняване и повишена експресия на DRP1, ключов фактор в митохондриалното делене [48]. Освен това, фрагментацията на митохондриите е свързана с общата сложност на мрежата, а преходът от сливане към делене е критичен за активирането на хематопоетичните стволови клетки (HSC), докато инхибирането на митохондриалното делене води до апоптоза на HSC [49]. По този начин, нашите резултати показват, че третирането с TGF-β1 може да индуцира намаляване на сложността на митохондриалната мрежа с намалено разклоняване, което е по-често срещано при митохондриално делене, свързано с активирани хематопоетични стволови клетки (HSC). Освен това, нашите данни показват, че IPA може да промени пропорцията на митохондриите от сферична към междинна форма, като по този начин намали експресията на OPA1 и MFN2. Проучванията показват, че понижаването на OPA1 може да причини намаляване на потенциала на митохондриалната мембрана и да задейства клетъчна апоптоза [50]. Известно е, че MFN2 медиира митохондриалното сливане и апоптозата [51]. Получените резултати показват, че индуцирането на LX-2 клетки от TGF-β1 и/или IPA изглежда модулира формата и размера на митохондриите, както и състоянието на активиране и сложността на мрежата.
Нашите резултати показват, че комбинираното лечение с TGFβ-1 и IPA може да намали mtDNA и клетъчните морфологични параметри чрез регулиране на експресията на mRNA на фиброза, апоптоза и гени, свързани с оцеляването, в клетки, избягващи апоптоза. Наистина, IPA намалява нивото на експресия на mRNA на AKT1 и важни гени за фиброза като COL1A2 и MMP2, но увеличава нивото на експресия на CASP8, който е свързан с апоптоза. Нашите резултати показват, че след лечение с IPA, експресията на BAX намалява, а експресията на mRNA на субединиците на семейството TIMP1, BCL-2 и NF-κB се увеличава, което предполага, че IPA може да стимулира сигналите за оцеляване в хематопоетичните стволови клетки (HSCs), които избягват апоптоза. Тези молекули могат да действат като про-оцелителни сигнали в активираните хематопоетични стволови клетки, което може да е свързано с повишена експресия на антиапоптотични протеини (като Bcl-2), намалена експресия на проапоптотичен BAX и сложно взаимодействие между TIMP и NF-κB [5, 7]. IPA проявява своите ефекти чрез PXR и ние открихме, че комбинираното лечение с TGF-β1 и IPA повишава нивата на експресия на PXR mRNA, което показва потискане на активирането на HSC. Известно е, че активираната PXR сигнализация инхибира активирането на HSC както in vivo, така и in vitro [52, 53]. Нашите резултати показват, че IPA може да участва в клирънса на активираните HSC чрез насърчаване на апоптозата, намаляване на фиброзата и митохондриалния метаболизъм и усилване на сигналите за оцеляване, които са типични процеси, които превръщат активирания HSC фенотип в инактивиран. Друго възможно обяснение за потенциалния механизъм и роля на IPA при апоптозата е, че той улавя дисфункционални митохондрии предимно чрез митофагия (вътрешен път) и външния TNF сигнален път (Таблица 1), който е пряко свързан със сигналния път за оцеляване на NF-κB (Допълнителна фигура 7). Интересно е, че обогатените с IPA гени са способни да индуцират проапоптотични и про-оцелителни сигнали в апоптотичния път [54], което предполага, че IPA може да индуцира апоптотичния път или оцеляване чрез взаимодействие с тези гени. Въпреки това, как IPA индуцира апоптоза или оцеляване по време на активирането на HSC и неговите механистични пътища остават неясни.
IPA е микробен метаболит, образуван от хранителен триптофан чрез чревната микробиота. Проучвания показват, че той има противовъзпалителни, антиоксидантни и епигенетични регулаторни свойства в чревната среда.[55] Проучванията показват, че IPA може да модулира чревната бариерна функция и да намали оксидативния стрес, което може да допринесе за неговите локални физиологични ефекти.[56] Всъщност IPA се транспортира до целевите органи чрез кръвообращението и тъй като IPA споделя подобна основна метаболитна структура с триптофан, серотонин и индолови производни, IPA упражнява метаболитни действия, водещи до конкурентна метаболитна съдба.[52] IPA може да се конкурира с метаболитите, получени от триптофан, за места на свързване с ензими или рецептори, потенциално нарушавайки нормалните метаболитни пътища. Това подчертава необходимостта от по-нататъшни изследвания на неговата фармакокинетика и фармакодинамика, за да се разбере по-добре неговият терапевтичен прозорец.[57] Остава да се види дали това може да се случи и в хематопоетичните стволови клетки (HSCs).
Признаваме, че нашето проучване има някои ограничения. За да изследваме специално асоциациите, свързани с IPA, изключихме пациенти със захарен диабет тип 2 (T2DM). Признаваме, че това ограничава широката приложимост на нашите открития към пациенти със захарен диабет тип 2 и напреднало чернодробно заболяване. Въпреки че физиологичната концентрация на IPA в човешки серум е 1–10 μM [11, 20], беше избрана концентрация от 1 mM IPA въз основа на най-високата нетоксична концентрация [15] и най-високия процент на апоптоза, без разлика в процента на популацията на некротичните клетки. Въпреки че в това проучване бяха използвани супрафизиологични нива на IPA, понастоящем няма консенсус относно ефективната доза IPA [52]. Въпреки че нашите резултати са значителни, по-широката метаболитна съдба на IPA остава активна област на изследване. Освен това, нашите открития относно връзката между серумните нива на IPA и ДНК метилирането на чернодробните транскрипти са получени не само от хематопоетични стволови клетки (HSCs), но и от чернодробни тъкани. Избрахме да използваме човешки LX-2 клетки въз основа на предишните ни открития от транскриптомен анализ, че IPA е свързан с активирането на хематопоетичните стволови клетки (HSC) [15] и HSC са основните клетки, участващи в прогресията на чернодробната фиброза. Черният дроб е съставен от множество клетъчни типове, така че други клетъчни модели, като например система за ко-култура на хепатоцити-HSC-имунни клетки, комбинирана с активиране на каспаза и фрагментация на ДНК, както и механизмът на действие, включително нивото на протеините, трябва да се вземат предвид, за да се изследва ролята на IPA и неговото взаимодействие с други видове чернодробни клетки.