Различни теории за растителната защита предоставят важни теоретични насоки за обяснение на моделите на специализирания метаболизъм на растенията, но техните ключови прогнози все още не са тествани. Тук използвахме безпристрастен тандем масспектрометричен (MS/MS) анализ, за ​​да изследваме систематично метаболома на атенюирани щамове на тютюна от отделни растения до популации и тясно свързани видове, и обработихме голям брой теории за масспектрометрични характеристики, базирани на съставни спектри в информацията. Рамка за тестване на ключовите прогнози за теориите за оптимална защита (OD) и движеща се цел (MT). Информационният компонент на растителната метаболомика е в съответствие с OD теорията, но противоречи на основното предсказание на MT теорията за динамиката на метаболомиката, причинена от тревопасни животни. От микро до макро еволюционен мащаб, жасмонатният сигнал беше идентифициран като основен детерминант на OD, докато етиленовият сигнал осигури фина настройка на специфичния за тревопасните животни отговор, анотиран от MS/MS молекулярната мрежа.
Специалните метаболити с разнообразни структури са основните участници в адаптацията на растенията към околната среда, особено в защитата им от врагове (1). Удивителната диверсификация на специалния метаболизъм, открит в растенията, е стимулирала десетилетия задълбочени изследвания върху многобройните му аспекти на екологичните функции и е формирала дълъг списък от теории за растителната защита, които представляват еволюционното и екологично развитие на взаимодействията между растенията и насекомите. Емпиричните изследвания предоставят важни насоки (2). Тези теории за растителната защита обаче не са следвали нормативния път на хипотетичното дедуктивно разсъждение, при което ключовите прогнози са били на едно и също ниво на анализ (3) и са били тествани експериментално, за да се постигне напредък в следващия цикъл на теоретично развитие (4). Техническите ограничения ограничават събирането на данни до специфични метаболитни категории и изключват цялостен анализ на специализирани метаболити, като по този начин предотвратяват междукатегорийните сравнения, които са от съществено значение за теоретичното развитие (5). Липсата на всеобхватни метаболомични данни и обща валута за сравняване на работния процес на обработка на метаболитното пространство между различните растителни групи възпрепятства научната зрялост на областта.
Най-новите разработки в областта на метаболомиката с тандемна масспектрометрия (MS/MS) могат да характеризират цялостно метаболитните промени в рамките на и между видовете от даден системен клад и могат да се комбинират с изчислителни методи за изчисляване на структурното сходство между тези сложни смеси. Предварителни познания по химия (5). Комбинацията от съвременни технологии в анализа и изчисленията осигурява необходимата рамка за дългосрочно тестване на много прогнози, направени от екологичните и еволюционните теории за метаболитно разнообразие. Шанън (6) въвежда теорията на информацията за първи път в своята основополагаща статия през 1948 г., полагайки основите на математическия анализ на информацията, който е използван в много области, различни от първоначалното му приложение. В геномиката теорията на информацията е успешно приложена за количествено определяне на консервативната информация за последователностите (7). В транскриптомичните изследвания теорията на информацията анализира общите промени в транскриптома (8). В предишни изследвания приложихме статистическата рамка на теорията на информацията към метаболомиката, за да опишем метаболитната експертиза на тъканно ниво в растенията (9). Тук комбинираме работния процес, базиран на MS/MS, със статистическата рамка на информационната теория, характеризираща се с метаболитно разнообразие в общата валута, за да сравним ключовите прогнози на теорията за растителната защита на метаболома, индуциран от тревопасни животни.
Теоретичните рамки на растителната защита обикновено са взаимно приобщаващи и могат да бъдат разделени на две категории: тези, които се опитват да обяснят разпределението на специфичните за растенията метаболити въз основа на защитните функции, като например оптимална защита (OD) (10), теория за движеща се цел (MT) (11) и теория за външния вид (12), докато други търсят механични обяснения за това как промените в наличността на ресурси влияят върху растежа на растенията и натрупването на специализирани метаболити, като например хипотеза за баланса въглерод:хранителни вещества (13), хипотеза за скоростта на растеж (14) и хипотеза за равновесието на растеж и диференциация (15). Двата комплекта теории са на различни нива на анализ (4). Две теории, включващи защитни функции на функционално ниво, обаче доминират в разговора за конститутивните и индуцируемите защити на растенията: OD теория, която приема, че растенията инвестират в своите скъпи химически защити само когато е необходимо, например, когато бъдат погълнати. Когато тревисто животно атакува, следователно, според възможността за бъдеща атака, се определя съединението със защитна функция (10); Хипотезата за МТ предполага, че няма ос на насочена промяна на метаболитите, а метаболитът се променя произволно, като по този начин създава възможност за възпрепятстване на метаболитната „цел на движение“ на атакуващите тревопасни животни. С други думи, тези две теории правят противоположни прогнози за метаболитното ремоделиране, което настъпва след атаката на тревопасните животни: връзката между еднопосочното натрупване на метаболити със защитна функция (ОД) и ненасочените метаболитни промени (МТ) (11).
Хипотезите за OD и MT включват не само индуцираните промени в метаболома, но и екологичните и еволюционните последици от натрупването на тези метаболити, като например адаптивните разходи и ползи от тези метаболитни промени в специфична екологична среда (16). Въпреки че и двете хипотези признават защитната функция на специализираните метаболити, които могат или не могат да бъдат скъпи, ключовото предсказание, което разграничава хипотезите за OD и MT, се крие в насочеността на индуцираните метаболитни промени. Предсказанието на теорията за OD е получило най-голямо експериментално внимание досега. Тези тестове включват изучаването на преките или индиректните защитни функции на различни тъкани на специфични съединения в оранжерии и естествени условия, както и промените в етапа на развитие на растенията (17-19). Въпреки това, досега, поради липсата на работен процес и статистическа рамка за глобален цялостен анализ на метаболитното разнообразие на който и да е организъм, основната разлика в предсказанието между двете теории (т.е. посоката на метаболитните промени) остава да бъде тествано. Тук предоставяме такъв анализ.
Една от най-значимите характеристики на специфичните за растенията метаболити е тяхното изключително структурно разнообразие на всички нива - от единични растения, популации до подобни видове (20). Много количествени промени в специализираните метаболити могат да се наблюдават на ниво популация, докато силни качествени разлики обикновено се поддържат на видово ниво (20). Следователно, растителното метаболитно разнообразие е основният аспект на функционалното разнообразие, отразяващ адаптивността към различни ниши, особено тези с различни възможности за инвазия от специални насекоми и обикновени тревопасни животни (21). След новаторската статия на Френкел (22) за причините за съществуването на специфични за растенията метаболити, взаимодействията с различни насекоми се считат за важен селективен натиск и се смята, че тези взаимодействия са оформили растенията по време на еволюцията. Метаболитен път (23). Междувидовите различия в разнообразието на специализираните метаболити могат също да отразяват физиологичния баланс, свързан с конститутивната и индуцируема растителна защита срещу тревопасни стратегии, тъй като двата вида често са отрицателно корелирани помежду си (24). Въпреки че може да е полезно да се поддържа добра защита по всяко време, навременните метаболитни промени, свързани със защитата, осигуряват ясни ползи, позволявайки на растенията да разпределят ценни ресурси към други физиологични инвестиции (19, 24) и да избегнат необходимостта от симбиоза. Съпътстващи щети (25). В допълнение, тези реорганизации на специализирани метаболити, причинени от насекоми тревопасни животни, могат да доведат до деструктивно разпределение в популацията (26) и могат да отразяват директни показания за съществени естествени промени в сигнала на жасмоновата киселина (JA), който може да се поддържа в популацията. Високите и ниските JA сигнали са компромиси между защитата срещу тревопасни животни и конкуренцията със специфични видове (27). В допълнение, специализираните биосинтетични пътища на метаболитите ще претърпят бърза загуба и трансформация по време на еволюцията, което ще доведе до неравномерно метаболитно разпределение сред тясно свързани видове (28). Тези полиморфизми могат да се установят бързо в отговор на променящите се модели на тревопасните животни (29), което означава, че флуктуацията на тревопасните общности е ключов фактор, движещ метаболитната хетерогенност.
Тук ние решихме следните задачи. (I) Как тревопасното насекомо преконфигурира растителния метаболом? (Ii) Кои са основните информационни компоненти на метаболитната пластичност, които могат да бъдат количествено определени, за да се тестват прогнозите на теорията за дългосрочната защита? (Iii) Дали да се препрограмира растителният метаболом по начин, уникален за атакуващия, и ако е така, каква роля играят растителният хормони при приспособяването на специфичен метаболитен отговор и кои метаболити допринасят за видовата специфичност на защитата? (Iv) Тъй като прогнозите, направени от много теории за защита, могат да бъдат разширени на всички нива на биологичните тъкани, ние се запитахме колко последователен е причиненият метаболитен отговор от вътрешно сравнение до междувидово сравнение? За тази цел систематично проучихме метаболома на листата на никотина в тютюна, който е екологично моделно растение с богат специализиран метаболизъм и е ефективен срещу ларвите на две местни тревопасни животни, Lepidoptera Datura (Ms) (Много агресивен, предимно се консумира). Върху Solanaceae и Spodoptera littoralis (Sl), листните червеи на памука са вид „род“, с растения гостоприемници от Solanaceae и други гостоприемници от други родове и семейства, които са растителна храна. Анализирахме MS/MS метаболомния спектър и извлякохме статистически дескриптори на информационната теория, за да сравним OD и MT теориите. Създадохме карти на специфичност, за да разкрием идентичността на ключовите метаболити. Анализът беше разширен до местната популация на N. nasi и тясно свързани видове тютюн, за да анализираме допълнително ковариацията между сигнализирането на растителните хормони и OD индуцирането.
За да получим обща карта за пластичността и структурата на метаболома на листата на тревопасния тютюн, използвахме предварително разработен работен процес за анализ и изчисление, за да съберем и деконволюираме цялостно данни с висока резолюция, независими MS/MS спектри от растителни екстракти (9). Този недиференциран метод (наречен MS/MS) може да конструира нередундантни спектри на съединения, които след това могат да се използват за всички анализи на ниво съединения, описани тук. Тези деконволюирани растителни метаболити са от различни видове, състоящи се от стотици до хиляди метаболити (около 500-1000-s/MS/MS тук). Тук разглеждаме метаболитната пластичност в рамките на теорията на информацията и определяме количествено разнообразието и професионализма на метаболома въз основа на ентропията на Шанън на разпределението на метаболитната честота. Използвайки предварително внедрената формула (8), изчислихме набор от индикатори, които могат да се използват за количествено определяне на разнообразието на метаболома (Hj индикатор), специализацията на метаболитния профил (δj индикатор) и метаболитната специфичност на отделен метаболит (Si индикатор). В допълнение, ние приложихме индекса на относителна пластичност на разстоянието (RDPI), за да определим количествено индуцируемостта на метаболома при тревопасните животни (Фигура 1А) (30). В рамките на тази статистическа рамка, ние третираме MS/MS спектъра като основна информационна единица и обработваме относителното изобилие на MS/MS в карта на честотното разпределение, след което използваме ентропията на Шанън, за да оценим разнообразието на метаболома от него. Специализацията на метаболома се измерва чрез средната специфичност на единичен MS/MS спектър. Следователно, увеличаването на изобилието на някои MS/MS класове след индукция при тревопасните животни се трансформира в спектрална индуцируемост, RDPI и специализация, т.е. увеличаване на индекса δj, защото се произвеждат по-специализирани метаболити и се произвежда висок Si индекс. Понижаването на индекса на разнообразие Hj отразява, че или броят на генерираните MS/MS е намален, или разпределението на честотата на профила се променя в по-неравномерна посока, като същевременно намалява общата му несигурност. Чрез изчисляването на Si индекса е възможно да се подчертае кои MS/MS са индуцирани от определени тревопасни животни и обратно, кои MS/MS не реагират на индукцията, което е ключов индикатор за разграничаване на прогнозата за MT и OD.
(A) Статистически дескриптори, използвани за индуцируемост на данни от MS/MS (RDPI), разнообразие (Hj индекс), специализация (δj индекс) и специфичност на метаболит (Si индекс) при тревопасни (H1 до Hx). Увеличаването на степента на специализация (δj) показва, че средно ще се произвеждат повече специфични за тревопасните метаболити, докато намаляването на разнообразието (Hj) показва намаляване на производството на метаболити или неравномерно разпределение на метаболитите в картата на разпределение. Стойността на Si оценява дали метаболитът е специфичен за дадено състояние (тук, тревопасни) или обратното, се поддържа на същото ниво. (B) Концептуална диаграма на прогнозата на теорията на защитата, използваща оста на теорията на информацията. Теорията на информационната теория предвижда, че атаката на тревопасните ще увеличи метаболитите на защитата, като по този начин ще увеличи δj. В същото време Hj намалява, защото профилът се реорганизира към намалена неопределеност на метаболитната информация. Теорията на MT предвижда, че атаката на тревопасните ще причини ненасочени промени в метаболома, като по този начин ще увеличи Hj като индикатор за повишена неопределеност на метаболитната информация и ще причини случайно разпределение на Si. Предложихме също смесен модел, най-добрият MT, при който някои метаболити с по-високи защитни стойности ще бъдат особено повишени (висока стойност на Si), докато други ще показват случайни реакции (по-ниска стойност на Si).
Използвайки дескриптори на информационната теория, ние интерпретираме теорията на OD, за да предвидим, че индуцираните от тревопасни животни промени в специални метаболити в неиндуцирано конститутивно състояние ще доведат до (i) увеличаване на метаболитната специфичност (Si индекс), което ще доведе до метабономна специфичност (δj индекс) (увеличение на) определени специални метаболитбени групи с по-висока защитна стойност, и (ii) намаляване на разнообразието на метаболома (Hj индекс) поради промяната в разпределението на метаболитната честота към по-голямо разпределение на лептиновите тела. На ниво един метаболит се очаква подредено разпределение на Si, където метаболитът ще увеличи стойността на Si според своята защитна стойност (Фигура 1B). В тази връзка, ние обясняваме МТ теорията, за да предвидим, че възбуждането ще доведе до (i) ненасочени промени в метаболитите, водещи до намаляване на δj индекса, и (ii) увеличаване на Hj индекса поради увеличаване на метаболитната неопределеност или случайност, която може да бъде количествено определена чрез ентропията на Шанън под формата на обобщено разнообразие. Що се отнася до метаболитния състав, МТ теорията ще предскаже случайното разпределение на Si. Като се има предвид, че някои метаболити са при специфични условия, а други не са, и тяхната защитна стойност зависи от околната среда, ние също така предложихме модел на смесена защита, в който δj и Hj са разпределени на две по дължина на Si. С увеличаване във всички посоки, само определени групи метаболити, които имат по-високи защитни стойности, ще увеличат Si по-специално, докато други ще имат произволно разпределение (Фигура 1B).
За да тестваме предсказанието на предефинираната теория на защитата по оста на дескриптора на информационната теория, създадохме експертни (Ms) или генералистични (Sl) ларви на тревопасни животни върху листата на Nepenthes pallens (Фигура 2A). Използвайки MS/MS анализ, извлякохме 599 нередундантни MS/MS спектъра (файл с данни S1) от метанолови екстракти от листна тъкан, събрана след хранене на гъсеници. Използването на RDPI, Hj и δj индекси за визуализиране на преконфигурацията на информационното съдържание в MS/MS конфигурационни файлове разкрива интересни модели (Фигура 2B). Общата тенденция е, че както е описано от информационния дескриптор, тъй като гъсениците продължават да ядат листа, степента на метаболитна реорганизация се увеличава с течение на времето: 72 часа след като тревопасното животно се нахрани, RDPI се увеличава значително. В сравнение с неувредения контрол, Hj е значително намален, което се дължи на повишената степен на специализация на метаболитния профил, която е количествено определена чрез индекса δj. Тази очевидна тенденция е в съответствие с прогнозите на теорията за органичната секреция (OD), но е несъвместима с основните прогнози на MT теорията, която смята, че случайните (непосочни) промени в нивата на метаболитите се използват като защитен камуфлаж (Фигура 1B). Въпреки че съдържанието на елиситор на оралната секреция (OS) и хранителното поведение на тези две тревопасни животни са различни, директното им хранене е довело до сходни промени в посоките на Hj и δj по време на 24-часовия и 72-часовия период на събиране на реколтата. Единствената разлика е наблюдавана на 72-ия час от RDPI. В сравнение с този, причинен от храненето с Ms, общият метаболизъм, индуциран от храненето с Sl, е бил по-висок.
(A) Експериментален дизайн: обикновени свине (S1) или експертни (Ms) тревопасни животни се хранят с обезсолени листа от растения стомна, докато за симулирана тревопасност се използва OS на Ms (W + OSMs) за обработка на пробиването на стандартизирани позиции на листата. S1 (W + OSSl) ларви или вода (W + W). Контролата (C) е невредим лист. (B) Индекс на индуцируемост (RDPI в сравнение с контролната карта), разнообразие (Hj индекс) и специализация (δj индекс), изчислен за картата на специалните метаболити (599 MS/MS; файл с данни S1). Звездичките показват значителни разлики между директното хранене на тревопасни животни и контролната група (t-тест на Стюдънт с сдвоен t-тест, *P<0,05 и ***P<0,001). ns, не е важно. (C) Индекс на времева резолюция на основния (синя кутия, аминокиселина, органична киселина и захар; файл с данни S2) и специалния метаболитен спектър (червена кутия 443 MS/MS; файл с данни S1) след симулирано третиране с тревопасни животни. Цветната лента се отнася до 95% доверителен интервал. Звездичката показва значителната разлика между третираната група и контролната група [квадратичен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от честно значимата разлика на Tukey (HSD) за post hoc множествени сравнения, *P<0,05, **P<0,01 и *** P <0,001]. (D) Специализация на точкови диаграми и профили на специални метаболити (повтарящи се проби с различни третирания).
За да изследваме дали индуцираното от тревопасните животни ремоделиране на ниво метаболом се отразява в промените в нивото на отделните метаболити, първо се фокусирахме върху метаболитите, изследвани преди това в листата на Nepenthes pallens с доказана резистентност към тревопасните животни. Фенолните амиди са хидроксицинамамид-полиаминови конюгати, които се натрупват по време на тревопасния процес на насекомите и е известно, че намаляват продуктивността на насекомите (32). Търсихме прекурсорите на съответните MS/MS и начертахме техните кумулативни кинетични криви (Фигура S1). Не е изненадващо, че фенолните производни, които не участват пряко в защитата срещу тревопасните животни, като хлорогенова киселина (CGA) и рутин, са понижени след тревопасния процес. За разлика от това, тревопасните животни могат да направят фенолните амиди силно потентни. Непрекъснатото хранене на двете тревопасни животни доведе до почти еднакъв спектър на възбуждане на феноламиди и този модел беше особено очевиден при de novo синтеза на феноламиди. Същото явление ще се наблюдава при изследване на пътя на 17-хидроксигеранил нонандиол дитерпенови гликозиди (17-HGL-DTGs), който произвежда голям брой ациклични дитерпени с ефективни анти-тревопасни функции (33), от които храненето с Ms със Sl е задействало подобен профил на експресия (Фигура S1).
Възможният недостатък на експериментите с директно хранене с тревопасни животни е разликата в скоростта на консумация на листа и времето за хранене на тревопасните животни, което затруднява елиминирането на специфичните за тревопасните ефекти, причинени от рани и тревопасни животни. За да решим по-добре видовата специфичност на индуцирания метаболитен отговор на листата при тревопасните животни, симулирахме храненето на ларвите на Ms и Sl, като незабавно приложихме прясно събраните OS (OSM и OSS1) към стандартната пункция W на постоянни позиции на листата. Тази процедура се нарича W + OS третиране и стандартизира индукцията чрез прецизно определяне на времето на началото на отговора, предизвикан от тревопасното животно, без да причинява объркващи ефекти от разликите в скоростта или количеството на загубата на тъкан (Фигура 2A) (34). Използвайки MS/MS анализа и изчислителния конвейер, извлякохме 443 MS/MS спектъра (файл с данни S1), които се припокриваха със спектрите, предварително сглобени от експерименти с директно хранене. Анализът на тази MS/MS база данни по теория на информацията показа, че препрограмирането на специализирани в листата метаболоми чрез симулиране на тревопасни животни показва специфични за OS стимули (Фигура 2C). По-специално, в сравнение с третирането с OSS1, OSM причинява засилване на специализацията на метаболома на 4-ия час. Заслужава да се отбележи, че в сравнение с експерименталния набор от данни за директно хранене с тревопасни животни, метаболитната кинетика, визуализирана в двуизмерно пространство, използвайки Hj и δj като координати, и насочеността на специализацията на метаболома в отговор на симулирано третиране с тревопасни животни с течение на времето се увеличават последователно (Фигура 2D). В същото време, ние количествено определихме съдържанието на аминокиселини, органични киселини и захари (файл с данни S2), за да изследваме дали това целенасочено увеличение на експертизата на метаболома се дължи на преконфигурацията на централния въглероден метаболизъм в отговор на симулирани тревопасни животни (Фигура S2). За да обясним по-добре този модел, ние допълнително наблюдавахме кинетиката на метаболитно натрупване на обсъжданите по-рано пътища на феноламид и 17-HGL-DTG. Специфичната за OS индукция на тревопасните животни се трансформира в диференциален модел на пренареждане в рамките на метаболизма на феноламид (Фигура S3). Фенолните амиди, съдържащи кумаринови и кафеоилови групи, се индуцират преференциално от OSS1, докато OSM предизвикват специфична индукция на ферулилови конюгати. За пътя 17-HGL-DTG е открита диференциална индукция на OS от продукти на маланилиране и дималонилиране надолу по веригата (Фигура S3).
След това изследвахме индуцираната от OS транскриптомна пластичност, използвайки набор от данни от микрочипове с времеви ход, който симулира използването на OSM за третиране на листата на розетковото растение при тревопасни животни. Кинетиката на вземане на проби основно се припокрива с кинетиката, използвана в това метаболомно проучване (35). В сравнение с реконфигурацията на метаболома, при която метаболитната пластичност е особено повишена с течение на времето, наблюдаваме преходни транскрипционни изблици в листата, индуцирани от Ms, където транскриптомната индуцируемост (RDPI) и специализацията (δj) са на 1. Имаше значително увеличение на часовете и разнообразието (Hj) в този момент, експресията на BMP1 беше значително намалена, последвано от релаксация на транскриптомната специализация (Фигура S4). Метаболитни генни семейства (като P450, гликозилтрансфераза и BAHD ацилтрансфераза) участват в процеса на сглобяване на специални метаболити от структурни единици, получени от първичния метаболизъм, следвайки гореспоменатия ранен модел на висока специализация. Като казус беше анализиран пътят на фенилаланина. Анализът потвърди, че основните гени в метаболизма на феноламида са силно OS-индуцирани при тревопасните животни в сравнение с непривлечените растения и са тясно свързани в своите модели на експресия. Транскрипционният фактор MYB8 и структурните гени PAL1, PAL2, C4H и 4CL в горния йерархичен участък на този път показват ранно започване на транскрипцията. Ацилтрансферазите, които играят роля в окончателното сглобяване на феноламида, като AT1, DH29 и CV86, показват продължителен модел на повишена регулация (Фигура S4). Горните наблюдения показват, че ранното започване на транскриптомната специализация и по-късното засилване на метаболомната специализация са свързан режим, което може да се дължи на синхронната регулаторна система, която инициира мощен защитен отговор.
Реконфигурацията в сигнализацията на растителните хормони действа като регулаторен слой, който интегрира информация за тревопасните животни, за да препрограмира физиологията на растенията. След симулацията на тревопасните животни, ние измерихме кумулативната динамика на ключови категории растителни хормони и визуализирахме времевата коекспресия между тях [коефициент на корелация на Пиърсън (PCC) > 0.4] (Фигура 3А). Както се очакваше, растителните хормони, свързани с биосинтеза, са свързани в мрежата за коекспресия на растителни хормони. Освен това, метаболитната специфичност (Si индекс) е картографирана към тази мрежа, за да се подчертаят растителните хормони, индуцирани от различни третирания. Очертани са две основни области на специфичен отговор при тревопасните животни: едната е в JA клъстера, където JA (неговата биологично активна форма JA-Ile) и други JA производни показват най-висок Si резултат; другата е етилен (ET). Гиберелинът показва само умерено повишаване на специфичността при тревопасните животни, докато други растителни хормони, като цитокинин, ауксин и абсцизова киселина, имат ниска индукционна специфичност за тревопасните животни. В сравнение с използването само на W + W, усилването на пиковата стойност на JA производните чрез приложението на OS (W + OS) може основно да се трансформира в силен специфичен индикатор за JA. Неочаквано, OSM и OSS1 с различно съдържание на елиситор са известни с това, че причиняват сходно натрупване на JA и JA-Ile. За разлика от OSS1, OSM е специфично и силно индуциран от OSM, докато OSS1 не усилва отговора на базалните рани (Фигура 3B).
(A) Анализ на коекспресионната мрежа, базиран на PCC изчисление на симулация на кинетиката на натрупване на растителни хормони, индуцирано от тревопасни животни. Възелът представлява единичен растителен хормон, а размерът на възела представлява Si индекса, специфичен за растителния хормон, между третиранията. (B) Натрупване на JA, JA-Ile и ET в листата, причинено от различни третирания, обозначени с различни цветове: кайсиево, W + OSM; синьо, W + OSSl; черно, W + W; сиво, C (контрола). Звездичките показват значителни разлики между третирането и контролата (двуфакторен ANOVA, последван от Tukey HSD post hoc множествено сравнение, *** P <0,001). Анализ на информационната теория на (C)697 MS/MS (файл с данни S1) в биосинтеза на JA и нарушен спектър на възприятие (irAOC и irCOI1) и (D)585 MS/MS (файл с данни S1) в ETR1 с нарушен ET сигнал. Две симулирани третирания с тревопасни животни задействаха растителни линии и контролни растения с празен носител (EV). Звездичките показват значителни разлики между третирането с W+OS и неувредената контрола (двуфакторен ANOVA, последван от Tukey HSD post hoc множествено сравнение, *P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001). (E) Разпръснати графики на разпръснато противопоставяне на специализацията. Цветовете представляват различни генетично модифицирани щамове; символите представляват различни методи на третиране: триъгълник, W + OSS1; правоъгълник, W + OSM; кръг C
След това използваме генетично модифициран щам на атенюирани Nepenthes (irCOI1 и sETR1) в ключовите стъпки на биосинтеза на JA и ET (irAOC и irACO) и възприятието (irCOI1 и sETR1), за да анализираме метаболизма на тези два растителни хормона върху тревопасните животни. Относителният принос на препрограмирането. В съответствие с предишни експерименти, ние потвърдихме индуцирането на OS от тревопасните животни в растения с празни носители (EV) (Фигура 3, C до D) и общото намаление на индекса Hj, причинено от OSM, докато индексът δj се увеличи. Отговорът е по-изразен от отговора, предизвикан от OSS1. Двулинейна графика, използваща Hj и δj като координати, показва специфичната дерегулация (Фигура 3E). Най-очевидната тенденция е, че при щамове без JA сигнал, разнообразието на метаболома и промените в специализацията, причинени от тревопасните животни, са почти напълно елиминирани (Фигура 3C). За разлика от това, тихото възприятие на ET при sETR1 растения, въпреки че общият ефект върху промените в метаболизма на тревопасните е много по-нисък от този на JA сигнализацията, намалява разликата в индексите Hj и δj между OSM и OSS1 възбужданията (Фигура 3D и Фигура S5). Това показва, че в допълнение към основната функция на JA сигналната трансдукция, ET сигналната трансдукция служи и за фина настройка на видово-специфичния метаболитен отговор на тревопасните животни. В съответствие с тази функция за фина настройка, не е имало промяна в общата индуцируемост на метаболома при sETR1 растения. От друга страна, в сравнение с sETR1 растенията, irACO растенията индуцират сходни общи амплитуди на метаболитни промени, причинени от тревопасните животни, но показват значително различни Hj и δj резултати между OSM и OSS1 предизвикателствата (Фигура S5).
За да идентифицираме специализирани метаболити, които имат важен принос към видово-специфичния отговор на тревопасните животни и да прецизираме тяхното производство чрез ET сигнали, използвахме предварително разработения структурен MS/MS метод. Този метод разчита на метода на би-клъстериране, за да преразгледа метаболитното семейство от MS/MS фрагменти [нормализирано скаларно произведение (NDP)] и оценка на сходство, базирана на неутрална загуба (NL). Наборът от MS/MS данни, конструиран чрез анализ на ET трансгенни линии, е произвел 585 MS/MS (файл с данни S1), които са били разделени чрез клъстерирането им в седем основни MS/MS модула (M) (Фигура 4A). Някои от тези модули са плътно опаковани с предварително характеризирани специални метаболити: например, M1, M2, M3, M4 и M7 са богати на различни фенолни производни (M1), флавоноидни гликозиди (M2), ацилни захари (M3 и M4) и 17-HGL-DTG (M7). Освен това се изчислява метаболитната специфична информация (Si индекс) на отделен метаболит във всеки модул и неговото Si разпределение може да се види интуитивно. Накратко, MS/MS спектрите, показващи висока тревопасна и генотипна специфичност, се характеризират с високи стойности на Si, а статистиката за ексцес показва разпределението на козината в десния ъгъл на опашката. Едно такова постно колоидно разпределение е открито в M1, където фенол амидът показва най-високата фракция на Si (Фигура 4B). Споменатият по-рано тревопасен индуцируем 17-HGL-DTG в M7 показва умерен Si резултат, което показва умерена степен на диференциална регулация между двата типа OS. За разлика от това, повечето конститутивно произведени специализирани метаболити, като рутин, CGA и ацилни захари, са сред най-ниските Si резултати. За да се изследва по-добре структурната сложност и разпределението на Si между специалните метаболити, за всеки модул е ​​изградена молекулярна мрежа (Фигура 4B). Важно предсказание на OD теорията (обобщено на Фигура 1B) е, че реорганизацията на специални метаболити след тревопасните насекоми би трябвало да доведе до еднопосочни промени в метаболитите с висока защитна стойност, особено чрез увеличаване на тяхната специфичност (за разлика от случайното разпределение). Режим) Защитен метаболит, предсказан от MT теорията. Повечето от фенолните производни, натрупани в M1, са функционално свързани с намаляването на производителността на насекомите (32). При сравняване на стойностите на Si в M1 метаболитите между индуцираните листа и съставните листа на контролните растения EV на 24 часа, наблюдавахме, че метаболитната специфичност на много метаболити след тревопасните насекоми има значителна тенденция на нарастване (Фигура 4C). Специфичното увеличение на стойността на Si е установено само в защитните феноламиди, но не е установено увеличение на стойността на Si в други феноли и неизвестни метаболити, съжителстващи в този модул. Това е специализиран модел, който е свързан с OD теорията. Основните прогнози за метаболитни промени, причинени от тревопасните насекоми, са последователни. За да проверим дали тази особеност на феноламидния спектър е индуцирана от OS-специфичен ET, ние начертахме метаболитния Si индекс и предизвикахме диференциална стойност на експресия между OSM и OSS1 в EV и sETR1 генотипите (Фигура 4D). В sETR1, индуцираната от фенамид разлика между OSM и OSS1 беше значително намалена. Методът на би-клъстериране беше приложен и към MS/MS данни, събрани в щамове с недостатъчна JA, за да се направят изводи за основните MS/MS модули, свързани с JA-регулираната метаболитна специализация (Фигура S6).
(A) Резултатите от клъстерирането на 585 MS/MS, базирани на споделен фрагмент (сходство на NDP) и споделена неутрална загуба (сходство на NL), водят до това, че модулът (M) е съвместим с известното семейство съединения или с неизвестен или слабо метаболизиран състав на метаболитите. До всеки модул е ​​показано специфичното (Si) разпределение на метаболита (MS/MS). (B) Модулна молекулярна мрежа: Възлите представляват MS/MS и ръбове, NDP (червено) и NL (синьо) MS/MS резултати (гранична стойност > 0.6). Градуираният индекс на специфичност на метаболитите (Si), оцветен въз основа на модула (вляво) и картографиран към молекулярната мрежа (вдясно). (C) Модул M1 на EV растение в конститутивно (контролно) и индуцирано състояние (симулирано тревопасно животно) на 24 часа: диаграма на молекулярната мрежа (стойността на Si е размерът на възела, защитният феноламид е маркиран в синьо). (D) Диаграма на молекулярната мрежа M1 на спектралната линия sETR1 с нарушено EV и ET възприятие: фенолното съединение, представено от зеления кръгов възел, и значителната разлика (P стойност) между третиранията W + OSM и W + OSS1 като размер на възела. CP, N-кафеоил-тирозин; CS, N-кафеоил-спермидин; FP, N-ферулов киселинен естер-пикочна киселина; FS, N-ферулил-спермидин; CoP, N', N “-кумаролил-тирозин; DCS, N', N”-дикафеоил-спермидин; CFS, N', N”-кафеоил, ферулоил-спермидин; Lycium barbarum в wolfberry Son; Nick. O-AS, O-ацилна захар.
Разширихме анализа от един атенюиран генотип на Nepenthes до естествени популации, където преди това са описани силни вътрешновидови промени в нивата на JA при тревопасните животни и специфичните нива на метаболити (26). Използвайте този набор от данни, за да обхванете 43 зародишни плазми. Тези зародишни плазми се състоят от 123 вида растения от N. pallens. Тези растения са взети от семена, събрани в различни местни местообитания в Юта, Невада, Аризона и Калифорния (Фигура S7), изчислихме разнообразието на метаболома (тук наречено ниво на популация) β разнообразие) и специализацията, причинена от OSM. В съответствие с предишни проучвания, наблюдавахме широк диапазон от метаболитни промени по осите Hj и δj, което показва, че зародишните плазми имат значителни разлики в пластичността на метаболитните си отговори към тревопасните животни (Фигура S7). Тази организация напомня на предишни наблюдения относно динамичния диапазон на промените в JA, причинени от тревопасните животни, и е поддържала много висока стойност в една популация (26, 36). Чрез използване на JA и JA-Ile за тестване на общата корелация на нивата между Hj и δj, установихме, че има значителна положителна корелация между JA и индекса на разнообразие и специализация на метаболома β (Фигура S7). Това предполага, че индуцираната от тревопасни животни хетерогенност в индукцията на JA, открита на популационно ниво, може да се дължи на ключови метаболитни полиморфизми, причинени от селекция от насекоми тревопасни животни.
Предишни проучвания показват, че видовете тютюн се различават значително по вид и относителна зависимост от индуцираните и конститутивни метаболитни защити. Смята се, че тези промени в предаването на сигнали срещу тревопасни животни и защитните способности се регулират от популационния натиск на насекомите, жизнения цикъл на растението и производствените разходи за защита в нишата, където расте даден вид. Изследвахме последователността на ремоделирането на метаболома на листата, индуцирано от тревопасни животни на шест вида Nicotiana, местни за Северна и Южна Америка. Тези видове са тясно свързани с Nepenthes North America, а именно Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, линеен тютюн, тютюн (Nicotiana spegazzinii) и тютюнев лист (Nicotiana obtusifolia) (Фигура 5А) (37). Шест от тези видове, включително добре характеризираният вид N. please, са едногодишни растения от клада petunia, а obtusifolia N. са многогодишни растения от сестринския клад Trigonophyllae (38). Впоследствие, индукция с W + W, W + OSM и W + OSS1 беше извършена върху тези седем вида, за да се изследва метаболитно пренареждане на храненето с насекоми на видово ниво.
(A) Филогенетично дърво, базирано на метода на максимална вероятност [за ядрен глутамин синтез (38)] и географското разпределение на седем тясно свързани вида Nicotiana (различни цветове) (37). (B) Точкова диаграма на специализираното разнообразие за метаболитните профили на седем вида Nicotiana (939 MS/MS; файл с данни S1). На видово ниво, разнообразието на метаболома е отрицателно корелирано със степента на специализация. Анализът на корелацията на видово ниво между метаболитното разнообразие, специализацията и натрупването на JA е показан на Фигура 2. S9. Цвят, различни видове; триъгълник, W + OSS1; правоъгълник, W + OSM; (C) Динамиката на JA и JA-Ile на Nicotiana е класирана според амплитудата на възбуждане на OS (двуфакторен ANOVA и Tukey HSD след множествено сравнение, * P <0,05, ** P <0,01 и * ** За сравнение на W + OS и W + W, P <0,001). Кутиевидна диаграма на (D) разнообразието и (E) специализацията на всеки вид след симулиране на тревопасен и метил JA (MeJA). Звездичката показва значителната разлика между W + OS и W + W или ланолин плюс W (Lan + W) или Lan плюс MeJA (Lan + MeJa) и контрола Lan (двупосочен дисперсионен анализ, последван от post hoc множествено сравнение на Tukey's HSD, *P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001).
Използвайки метода на двойните клъстери, идентифицирахме 9 модула от 939 MS/MS (файл с данни S1). Съставът на MS/MS, преконфигуриран чрез различни третирания, варира значително между различните модули между видовете (Фигура S8). Визуализирането на Hj (наричано тук видово γ-разнообразие) и δj показва, че различните видове се агрегират в много различни групи в метаболитното пространство, където разделянето на видово ниво обикновено е по-изразено от възбуждането. С изключение на N. linear и N. obliquus, те показват широк динамичен диапазон от индукционни ефекти (Фигура 5B). За разлика от това, видове като N. purpurea и N. obtusifolia имат по-малко очевиден метаболитен отговор на третирането, но метаболомът е по-разнообразен. Видоспецифичното разпределение на индуцирания метаболитен отговор доведе до значителна отрицателна корелация между специализацията и гама-разнообразието (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Индуцираните от OS промени в нивата на JAs са положително корелирани със специализацията на метаболома и отрицателно корелирани с метаболитното гама разнообразие, проявено от всеки вид (Фигура 5B и Фигура S9). Заслужава да се отбележи, че видовете, разговорно наричани видове с „сигнален отговор“ на Фигура 5C, като Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute и Nepenthes attenuated, са причинили значителни признаци на 30-та минута. Неотдавнашните OS-специфични огнища на JA и JA-Ile, докато други бактерии, наречени „сигнално неотзивчиви“, като Nepenthes mills, Nepenthes powdery и N. obtusifolia, показват само JA-Ile Edge индукция без никаква OS специфичност (Фигура 5C). На метаболитно ниво, както е споменато по-горе, за атенуирани Nepenthes, сигнално-отзивчивите вещества показват OS специфичност и значително увеличават δj, като същевременно намаляват Hj. Този OS-специфичен прайминг ефект не е открит при видове, класифицирани като сигнално нереактивни видове (Фигура 5, D и E). Специфичните за ОС метаболити се споделят по-често между сигнално-чувствителни видове и тези сигнални клъстери се групират с видове с по-слаби сигнални отговори, докато видовете с по-слаби сигнални отговори показват по-малка взаимозависимост (Фигура S8). Този резултат показва, че специфичната за ОС индукция на JAs и специфичната за ОС реконфигурация на низходящия метаболом са свързани на видово ниво.
След това използвахме ланолинова паста, съдържаща метил JA (MeJA), за третиране на растения, за да изследваме дали тези начини на свързване са ограничени от наличието на JA, приложен от екзогенен JA, който ще бъде в цитоплазмата на растенията. Бързата деестерификация е JA. Установихме същата тенденция на постепенна промяна от сигнално-чувствителни видове към сигнално-нечувствителни видове, причинена от непрекъснатото снабдяване с JA (Фигура 5, D и E). Накратко, третирането с MeJA силно препрограмира метаболомите на линейни нематоди, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens и N. mikimotoi, което води до значително увеличение на δj и намаляване на Hj. N. purpurea само показва увеличение на δj, но не и Hj. N. obtusifolia, за която преди това е доказано, че натрупва изключително ниски нива на JA, също реагира слабо на третиране с MeJA по отношение на реконфигурация на метаболома. Тези резултати показват, че производството на JA или сигналната трансдукция е физиологично ограничено при сигнално-нечувствителни видове. За да тестваме тази хипотеза, изследвахме четирите вида (N. pallens, N. mills, N. pink и N. microphylla), индуцирани от W + W, W + OSMs и W + OSS1 транскриптоми (39). В съответствие с модела на ремоделиране на метаболома, видовете са добре разделени в транскриптомното пространство, сред които N. attenuated показа най-висок OS-индуциран RDPI, докато N. gracilis имаше най-нисък (Фигура 6А). Установено е обаче, че транскриптомното разнообразие, индуцирано от N. oblonga, е най-ниското сред четирите вида, противно на най-високото метабономно разнообразие на N. oblonga, показано преди това при седем вида. Предишни проучвания показват, че набор от гени, свързани с ранните защитни сигнали, включително JA сигналите, обяснява специфичността на ранните защитни реакции, индуцирани от елиситори, свързани с тревопасни животни, при видовете Nicotiana (39). Сравняването на JA сигналните пътища между тези четири вида разкри интересен модел (Фигура 6B). Повечето гени в този път, като AOC, OPR3, ACX и COI1, показаха относително високи нива на индукция при тези четири вида. Ключов ген, JAR4, обаче превръща JA в неговата биологично активна форма от натрупани JA-Ile транскрипти, а нивото му на транскрипция е много ниско, особено при N. mills, Nepenthes pieris и N. microphylla. Освен това, само транскриптът на друг ген AOS не беше открит при N. bifidum. Тези промени в генната експресия може да са причина за екстремните фенотипове, индуцирани от ниското производство на JA при сигнално анергични видове и индукцията на N. gracilis.
(A) Анализ на информационната теория на препрограмирането на ранните транскрипционни отговори на четири тясно свързани вида тютюн, взети 30 минути след индуциране на тревопасна популация. RDPI се изчислява чрез сравняване на листата, индуцирани от OS на тревопасно животно, с контролната група от рани. Цветовете показват различни видове, а символите показват различни методи на третиране. (B) Анализ на генната експресия в JA сигналните пътища сред четири вида. Опростеният JA път е показан до диаграмата. Различните цветове показват различни методи на обработка. Звездичката показва, че има значителна разлика между третирането с W + OS и контролата W + W (за t-теста на Стюдънт за двойни разлики, *P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001). OPDA, 12-оксофитодиенова киселина; OPC-8: 0,3-оксо-2(2′(Z)-пентенил)-циклопентан-1-октанова киселина.
В последната част изследвахме как специфичното за видовете насекоми ремоделиране на метаболома на различни растителни видове може да бъде резистентно към тревопасните животни. Предишни изследвания наблягаха на рода Nicotiana. Тяхната резистентност към Ms и ларвите се различава значително (40). Тук изследвахме връзката между този модел и тяхната метаболитна пластичност. Използвайки горните четири вида тютюн и тествайки корелацията между разнообразието и специализацията на метаболома, причинени от тревопасните животни, и резистентността на растенията към Ms и Sl, установихме, че резистентността, разнообразието и специализацията към универсалния Sl са положително корелирани, докато корелацията между резистентността към експертни дами и специализацията е слаба, а корелацията с разнообразието не е значителна (Фигура S10). По отношение на резистентността към S1, както атенюираните N. chinensis, така и N. gracilis, за които преди това беше показано, че показват както нива на JA сигнална трансдукция, така и пластичност на метаболома, имаха значително различни отговори на индукция от тревопасни животни и също така показаха сходна висока резистентност. Пол.
През последните шестдесет години теорията за растителната защита предостави теоретична рамка, въз основа на която изследователите са предвидили значителен брой еволюции и функции на специализирани растителни метаболити. Повечето от тези теории не следват нормалната процедура на силни изводи (41). Те предлагат ключови прогнози (3) на едно и също ниво на анализ. Когато тестването на ключови прогнози позволява анализ на специфични теории, това ще направи полето да се движи напред. Да бъдат подкрепени, но отхвърлени други (42). Вместо това, новата теория прави прогнози на различни нива на анализ и добавя нов слой описателни съображения (42). Двете теории, предложени на функционално ниво, MT и OD, обаче могат лесно да бъдат обяснени като важни прогнози за специализирани метаболитни промени, причинени от тревопасни животни: OD теорията смята, че промените в специализираното метаболитно „пространство“ са силно насочени. MT теорията смята, че тези промени ще бъдат ненасочени и произволно разположени в метаболитното пространство и са склонни да имат метаболити с висока защитна стойност. Предишни изследвания на OD и MT прогнозите са тествани с помощта на тесен набор от априорни „защитни“ съединения. Тези метаболит-центрични тестове изключват възможността за анализ на степента и траекторията на реконфигурация на метаболома по време на тревопасност и не позволяват тестването в рамките на последователна статистическа рамка да изисква ключови прогнози, които могат да се разглеждат като цяло. Количествено определяне на промените в растителния метаболом. Тук използвахме иновативната технология в метаболомиката, базирана на изчислителна мас-спектърна спектроскопия (MS), и извършихме деконволюционен MS анализ в общата валута на дескрипторите на информационната теория, за да тестваме разликата между двете, предложени на глобално ниво на метаболомика. Ключовото предсказание на тази теория. Информационната теория е прилагана в много области, особено в контекста на изследванията на биоразнообразието и потока на хранителни вещества (43). Доколкото ни е известно обаче, това е първото приложение, използвано за описание на метаболитното информационно пространство на растенията и решаване на екологични проблеми, свързани с временни метаболитни промени в отговор на екологични сигнали. По-специално, способността на този метод се състои в способността му да сравнява модели в рамките на и между растителните видове, за да изследва как тревопасните животни са еволюирали от различни видове до междувидови макроеволюционни модели на различни нива на еволюция. Метаболизъм.
Анализът на главните компоненти (PCA) преобразува многовариантен набор от данни в пространство за намаляване на размерността, така че основната тенденция в данните може да бъде обяснена, така че обикновено се използва като изследователска техника за анализ на набора от данни, като например деконволюционен метаболом. Намаляването на размерността обаче ще загуби част от информационното съдържание в набора от данни и PCA не може да предостави количествена информация за характеристики, които са особено важни за екологичната теория, като например: как тревопасните преконфигурират разнообразието в специализирани области (например, богатство, разпространение) и изобилие) метаболити? Кои метаболити са предсказващи фактори за индуцираното състояние на дадено тревопасно животно? От гледна точка на специфичността, разнообразието и индуцируемостта, информационното съдържание на специфичния за листата метаболитен профил се разлага и се установява, че храненето на тревопасните животни може да активира специфичен метаболизъм. Неочаквано наблюдавахме, че както е описано в приложените индикатори на информационната теория, получената метаболитна ситуация има голямо припокриване след атаките на двете тревопасни животни (нощно хранения генералист Sl) и експерта Solanaceae Ms. Въпреки че тяхното хранително поведение и концентрация са значително различни. Инициатор на конюгат мастна киселина-аминокиселинен (FAC) в OS (31). Чрез използване на OS от тревопасни животни за лечение на стандартизирани прободни рани, симулираното третиране с тревопасни животни също показа подобна тенденция. Тази стандартизирана процедура за симулиране на реакцията на растенията към атаки на тревопасни животни елиминира объркващите фактори, причинени от промени в хранителното поведение на тревопасните животни, които водят до различна степен на увреждане в различно време (34). FAC, който е известен като основната причина за OSM, намалява JAS и други растителни хормонални отговори в OSS1, докато OSS1 намалява стотици пъти (31). OSS1 обаче причинява подобни нива на натрупване на JA в сравнение с OSM. Преди това е доказано, че реакцията на JA в атенюирани Nepenthes е много чувствителна към OSM, където FAC може да поддържа своята активност дори ако е разреден 1:1000 с вода (44). Следователно, в сравнение с OSM, въпреки че FAC в OSS1 е много нисък, той е достатъчен, за да предизвика достатъчно огнище на JA. Предишни проучвания показват, че порин-подобни протеини (45) и олигозахариди (46) могат да бъдат използвани като молекулярни улики за задействане на защитни реакции на растенията в OSS1. Все още обаче не е ясно дали тези елиситори в OSS1 са отговорни за натрупването на JA, наблюдавано в настоящото проучване.
Въпреки че има малко проучвания, описващи диференциалните метаболитни отпечатъци, причинени от прилагането на различни тревопасни животни или екзогенни JA или SA (салицилова киселина) (47), никой не е нарушил специфичното за вида тревопасно смущение в растителната тревна мрежа и неговите ефекти върху специфичната лична информация. Цялостното въздействие на метаболизма е систематично изследвано. Този анализ допълнително потвърди, че връзката на вътрешната хормонална мрежа с други растителни хормони, различни от JA, оформя специфичността на метаболитната реорганизация, причинена от тревопасните животни. По-специално, открихме, че ET, причинен от OSM, е значително по-голям от този, причинен от OSS1. Този режим е в съответствие с по-голямо съдържание на FAC в OSM, което е необходимо и достатъчно условие за задействане на ET взрив (48). В контекста на взаимодействието между растения и тревопасни животни, сигналната функция на ET върху специфичната за растенията метаболитна динамика е все още спорадична и е насочена само към една група съединения. Освен това, повечето проучвания са използвали екзогенно приложение на ET или неговите прекурсори или различни инхибитори, за да изследват регулацията на ET, сред които тези екзогенни химични приложения ще предизвикат много неспецифични странични ефекти. Доколкото ни е известно, това проучване представлява първото мащабно систематично изследване на ролята на ЕТ в използването му за производство и възприемане на увредени трансгенни растения за координиране на динамиката на растителния метаболом. Специфичната за тревопасните животни ЕТ индукция може в крайна сметка да модулира метаболомния отговор. Най-значима е трансгенната манипулация на гените за биосинтеза (ACO) и възприятие (ETR1), която разкри специфичното за тревопасните животни de novo натрупване на феноламиди. По-рано е показано, че ЕТ може да фино настройва индуцираното от JA натрупване на никотин чрез регулиране на путресцин N-метилтрансфераза (49). От механична гледна точка обаче не е ясно как ЕТ фино настройва индуцирането на фенамид. В допълнение към функцията за сигнална трансдукция на ЕТ, метаболитният поток може също да бъде насочен към S-аденозил-1-метионин, за да се регулира инвестирането в полиаминофенолни амиди. S-аденозил-1-метионинът е ЕТ и общ междинен продукт на пътя на биосинтеза на полиамини. Механизмът, чрез който ЕТ сигналът регулира нивото на феноламид, се нуждае от допълнително проучване.
Дълго време, поради големия брой специални метаболити с неизвестна структура, интензивното внимание към специфични метаболитни категории не е било в състояние да оцени стриктно времевите промени в метаболитното разнообразие след биологични взаимодействия. Понастоящем, въз основа на анализ на теорията на информацията, основният резултат от MS/MS спектралното събиране, базирано на безпристрастни метаболити, е, че тревопасните, които се хранят или симулират тревопасни, продължават да намаляват общото метаболитно разнообразие на метаболома на листа, като същевременно увеличават степента му на специализация. Това временно увеличение на специфичността на метаболома, причинено от тревопасните, е свързано със синергично увеличение на специфичността на транскриптома. Характеристиката, която допринася най-много за тази по-голяма специализация на метаболома (с по-висока стойност на Si), е специалният метаболит с предварително характеризираната тревопасна функция. Този модел е в съответствие с прогнозата на теорията за органоструктурния растеж (OD), но прогнозата за MT, свързана със случайността на препрограмирането на метаболома, не е последователна. Тези данни обаче са в съответствие и с прогнозата на смесения модел (най-добра MT; Фигура 1B), тъй като други нехарактеризирани метаболити с неизвестни защитни функции все още могат да следват случайно разпределение на Si.
Забележителна закономерност, допълнително уловена от това изследване, е, че от микроеволюционно ниво (едно растение и популация на тютюн) до по-голям еволюционен мащаб (тясно свързани видове тютюн), различните нива на еволюционна организация са в „най-добра защита“. Съществуват значителни разлики в способностите на тревопасните животни. Moore et al. (20) и Kessler и Kalske (1) независимо предложиха да се преобразуват трите функционални нива на биоразнообразие, първоначално разграничени от Whittaker (50), в конститутивни и индуцирани времеви промени на химическото разнообразие; нито тези автори обобщиха процедурите за събиране на данни за метаболоми в голям мащаб, нито очертават как да се изчисли метаболитното разнообразие от тези данни. В това проучване, малки корекции във функционалната класификация на Whittaker ще разглеждат α-метаболитното разнообразие като разнообразие на MS/MS спектрите в дадено растение, а β-метаболитното разнообразие като основен вътревидов метаболизъм на група популации, а γ-метаболитното разнообразие ще бъде разширение на анализа на подобни видове.
JA сигналът е от съществено значение за широк спектър от метаболитни реакции на тревопасните животни. Липсват обаче строги количествени тестове на приноса на вътрешновидовата регулация на JA биосинтеза за разнообразието на метаболома и дали JA сигналът е общо място за индуцирана от стрес метаболитна диверсификация в по-висок макроеволюционен мащаб все още е неясно. Наблюдавахме, че тревопасният характер на тревопасния Nepenthes индуцира специализация на метаболома и вариациите в специализацията на метаболома в популацията на видовете Nicotiana и сред тясно свързаните видове Nicotiana са систематично положително корелирани с JA сигнализацията. Освен това, когато JA сигналът е нарушен, метаболитната специфичност, индуцирана от един генотип тревопасно животно, ще бъде анулирана (Фигура 3, C и E). Тъй като промените в метаболитния спектър на естествено атенюираните популации на Nepenthes са предимно количествени, промените в метаболитното β разнообразие и специфичност в този анализ може да са до голяма степен причинени от силното възбуждане на богатите на метаболити категории съединения. Тези класове съединения доминират част от профила на метаболома и водят до положителна корелация с JA сигналите.
Тъй като биохимичните механизми на видовете тютюн, тясно свързани с него, са много различни, метаболитите са специфично идентифицирани в качествен аспект, така че е по-аналитичен. Обработката на заснетия метаболитен профил от информационната теория разкрива, че индукцията при тревопасните животни изостря компромиса между метаболитното гама разнообразие и специализацията. JA сигналът играе централна роля в този компромис. Увеличаването на специализацията на метаболома е в съответствие с основната прогноза за OD и е положително корелирано с JA сигнала, докато JA сигналът е отрицателно корелиран с метаболитното гама разнообразие. Тези модели показват, че OD капацитетът на растенията се определя главно от пластичността на JA, независимо дали в микроеволюционен мащаб или в по-голям еволюционен мащаб. Екзогенни експерименти с приложение на JA, които заобикалят дефектите в биосинтеза на JA, допълнително разкриват, че тясно свързаните видове тютюн могат да бъдат разграничени в сигнално-чувствителни и сигнално-нечувствителни видове, точно както техният начин на JA и метаболомната пластичност, индуцирана от тревопасни животни. Сигнално-нечувствителните видове не могат да реагират поради неспособността си да произвеждат ендогенен JA и следователно са подложени на физиологични ограничения. Това може да се дължи на мутации в някои ключови гени в JA сигналния път (AOS и JAR4 в N. crescens). Този резултат подчертава, че тези междувидови макроеволюционни модели може да се дължат главно на промени във вътрешното възприятие и реакция на хормоните.
В допълнение към взаимодействието между растенията и тревопасните животни, изследването на метаболитното разнообразие е свързано с всички важни теоретични постижения в изследването на биологичната адаптация към околната среда и еволюцията на сложни фенотипни черти. С увеличаването на количеството данни, получени от съвременните MS инструменти, тестването на хипотези за метаболитното разнообразие вече може да надхвърли индивидуалните/категорийните метаболити и да извърши глобален анализ, за ​​да разкрие неочаквани модели. В процеса на мащабен анализ, важна метафора е идеята за създаване на смислени карти, които могат да се използват за изследване на данни. Следователно, важен резултат от настоящата комбинация от безпристрастна MS/MS метаболомика и теория на информацията е, че тя предоставя проста метрика, която може да се използва за изграждане на карти за разглеждане на метаболитното разнообразие в различни таксономични мащаби. Това е основното изискване на този метод. Изследването на микро/макро еволюцията и екологията на общностите.
На макроеволюционно ниво, ядрото на теорията за коеволюцията на растенията и насекомите на Ерлих и Рейвън (51) е да предскаже, че вариацията в междувидовото метаболитно разнообразие е причина за диверсификацията на растителните линии. Въпреки това, през петдесетте години след публикуването на тази основополагаща работа, тази хипотеза рядко е била тествана (52). Това до голяма степен се дължи на филогенетичните характеристики на сравними метаболитни характеристики в дългите растителни линии. Рядкостта може да се използва за закрепване на методи за целеви анализ. Настоящият MS/MS работен процес, обработен от информационната теория, количествено определя структурното сходство на MS/MS на неизвестни метаболити (без предварителен подбор на метаболити) и преобразува тези MS/MS в набор от MS/MS, като по този начин в професионалния метаболизъм. Тези макроеволюционни модели се сравняват в класификационна скала. Прости статистически показатели. Процесът е подобен на филогенетичния анализ, който може да използва подравняване на последователности, за да определи количествено скоростта на диверсификация или еволюцията на характера без предварително прогнозиране.
На биохимично ниво, хипотезата за скрининг на Firn и Jones (53) показва, че метаболитното разнообразие се поддържа на различни нива, за да осигури суровини за упражняване на биологичната активност на преди това несвързани или заместени метаболити. Методите на теорията на информацията предоставят рамка, в която тези метаболит-специфични еволюционни преходи, които се случват по време на метаболитната специализация, могат да бъдат количествено определени като част от предложения еволюционен скрининг процес: биологично активна адаптация от ниска специфичност към висока специфичност. Инхибирани метаболити на дадена среда.
Като цяло, в ранните дни на молекулярната биология са разработени важни теории за защита на растенията, а дедуктивните методи, основани на хипотези, се считат за единственото средство за научен прогрес. Това до голяма степен се дължи на техническите ограничения при измерването на целия метаболом. Въпреки че методите, основани на хипотези, са особено полезни при избора на други причинно-следствени механизми, тяхната способност да разширят разбирането ни за биохимичните мрежи е по-ограничена от изчислителните методи, налични в момента в съвременната наука, използваща интензивни данни. Следователно, теориите, които не могат да бъдат предвидени, са далеч отвъд обхвата на наличните данни, така че хипотетичният цикъл на формула/тест на напредъка в областта на изследванията не може да бъде премахнат (4). Предвиждаме, че изчислителният работен процес на метаболомиката, представен тук, може да съживи интереса към последните (как) и окончателните (защо) въпроси на метаболитно разнообразие и да допринесе за нова ера на теоретично насочена наука за данните. Ерата преразгледа важните теории, вдъхновили предишните поколения.
Директното хранене с тревопасни животни се осъществява чрез отглеждане на ларва във втори стадий или Sl ларва върху един лист от бледо оцветено растение стомна от едно цъфтящо розоцветно растение, с 10 растителни повторения на растение. Ларвите на насекомите са захванати със скоби, а останалата листна тъкан е събрана 24 и 72 часа след заразяването и е замразена бързо, а метаболитите са екстрахирани.
Симулирайте третиране с тревопасни животни по силно синхронизиран начин. Методът е да се използват колела с платнени шарки, за да се пробият три реда тръни от всяка страна на средната жилка на трите напълно разгърнати листа на растението по време на етапа на растеж на платнената гирлянда и незабавно да се приложи разреден 1:5 Ms. Или да се използват ръкавици, за да се вкара S1 OS в раната от пробождането. Съберете и обработете листо, както е описано по-горе. Използвайте описания по-горе метод за екстрахиране на първични метаболити и растителни хормони (54).
За екзогенни приложения на JA, трите дръжкови листа на всяко от шестте розоцъфтящи растения от всеки вид се третират с 20 μl ланолинова паста, съдържаща 150 μg MeJA (Lan + MeJA), и 20 μl ланолин плюс третиране на рани (Lan + W) или се използват 20 μl чист ланолин като контрола. Листата се събират 72 часа след третирането, замразяват се бързо в течен азот и се съхраняват при -80°C до употреба.
В нашата изследователска група са идентифицирани четири трансгенни линии на JA и ET, а именно irAOC (36), irCOI1 (55), irACO и sETR1 (48). irAOC показва силно намаление на нивата на JA и JA-Ile, докато irCOI1 не е чувствителна към JA. В сравнение с EV, натрупването на JA-Ile се увеличава. По подобен начин, irACO ще намали производството на ET, а в сравнение с EV, sETR1, който е нечувствителен към ET, ще увеличи производството на ET.
За неинвазивно измерване на ET се използва фотоакустичен лазерен спектрометър (Sensor Sense ETD-300 сензор за ET в реално време). Веднага след третирането половината от листата бяха отрязани и прехвърлени в 4-милилитров запечатан стъклен флакон, а пространството над водата се остави да се натрупа в рамките на 5 часа. По време на измерването всеки флакон беше продухан с поток от 2 литра/час чист въздух в продължение на 8 минути, който предварително е преминал през катализатор, предоставен от Sensor Sense, за отстраняване на CO2 и вода.
Данните от микрочиповете първоначално са публикувани в (35) и са запазени в изчерпателната база данни за генна експресия на Националния център за биотехнологична информация (NCBI) (номер за достъп GSE30287). За това проучване са извлечени данните, съответстващи на листата, причинени от третирането с W + OSMs, и неувредения контролен вариант. Суровият интензитет е log2. Преди статистическия анализ, базовата линия е преобразувана и нормализирана до 75-ия си персентил, използвайки софтуерния пакет R.
Оригиналните данни за РНК секвениране (RNA-seq) на видовете Nicotiana са извлечени от архивите за кратко четене на NCBI (SRA), номер на проект PRJNA301787, който е докладван от Zhou et al. (39) и се процедира както е описано в (56). Суровите данни, обработени от W + W, W + OSM и W + OSS1, съответстващи на видовете Nicotiana, са избрани за анализ в това проучване и обработени по следния начин: Първо, суровите показания на RNA-seq са конвертирани във FASTQ формат. HISAT2 конвертира FASTQ в SAM, а SAMtools конвертира SAM файловете в сортирани BAM файлове. StringTie се използва за изчисляване на генната експресия, а методът му на експресия е, че има фрагменти на хиляда базови фрагмента на милион секвенирани транскрипционни фрагменти.
Хроматографската колона Acclaim (150 mm x 2,1 mm; размер на частиците 2,2 μm), използвана в анализа, и предпазната колона 4 mm x 4 mm са изработени от един и същ материал. В системата Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) се използва следният бинарен градиент: 0 до 0,5 минути, изократичен 90% A [дейонизирана вода, 0,1% (v/v) ацетонитрил и 0,05% мравчена киселина], 10% B (ацетонитрил и 0,05% мравчена киселина); 0,5 до 23,5 минути, градиентната фаза е съответно 10% A и 90% B; 23,5 до 25 минути, изократичен 10% A и 90% B. Дебитът е 400 μl/min. За всички MS анализи, инжектирайте елуента на колоната в квадруполен и времепролетен (qTOF) анализатор, оборудван с електроспрей източник, работещ в режим на положителна йонизация (капилярно напрежение, 4500 V; капилярен изход 130 V; температура на сушене 200°C; дебит на въздушния поток при сушене 10 литра/мин).
Извършете MS/MS фрагментен анализ (наричан по-долу MS/MS), който е ирелевантен или неразличим от данните, за да получите структурна информация за общия откриваем метаболитен профил. Концепцията на неселективния MS/MS метод се основава на факта, че квадруполът има много голям прозорец за изолация на масата [следователно, считайте всички сигнали за съотношение маса-заряд (m/z) за фрагменти]. Поради тази причина, тъй като инструментът Impact II не успя да създаде CE наклон, бяха извършени няколко независими анализа, използвайки увеличени стойности на индуцираната от сблъсък дисоциационна енергия (CE). Накратко, първо анализирайте пробата чрез UHPLC-електроспрей йонизация/qTOF-MS, използвайки режим на единична масспектрометрия (условия на ниска фрагментация, генерирани от фрагментация в източника), сканирайки от m/z 50 до 1500 при честота на повторение 5 Hz. Използвайте азот като газ за сблъсък за MS/MS анализ и извършете независими измервания при следните четири различни напрежения на дисоциация, индуцирана от сблъсък: 20, 30, 40 и 50 eV. По време на целия процес на измерване, квадруполът има най-големия прозорец за изолация на масата, от m/z 50 до 1500. Когато експериментът с m/z на предното тяло и ширината на изолация е настроен на 200, диапазонът на масата се активира автоматично от операционния софтуер на инструмента и 0 Da. Сканирайте за фрагменти от масата, както в режим на единична маса. Използвайте натриев формиат (50 ml изопропанол, 200 μl мравчена киселина и 1 ml 1M воден разтвор на NaOH) за калибриране на масата. Използвайки алгоритъма за високопрецизна калибриране на Bruker, файлът с данни се калибрира след осредняване на спектъра за даден период от време. Използвайте функцията за експортиране на софтуера Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Бремен, Германия), за да конвертирате суровите файлове с данни във формат NetCDF. Наборът от данни MS/MS е запазен в отворената база данни за метаболомика MetaboLights (www.ebi.ac.uk) с номер за достъп MTBLS1471.
MS/MS асемблирането може да се осъществи чрез корелационен анализ между MS1 и MS/MS сигналите за качество за ниска и висока енергия на сблъсък и нововъведени правила. R скриптът се използва за осъществяване на корелационен анализ на разпределението на прекурсора към продукта, а C# скриптът (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) се използва за имплементиране на правилата.
За да намалим фалшиво положителните грешки, причинени от фонов шум и фалшива корелация, причинена от откриване на определени m/z характеристики само в няколко проби, използваме функцията „запълнен пик“ на R пакета XCMS (за корекция на фоновия шум). Тя трябва да се използва за заместване на интензитета „NA“ (неоткрит пик). Когато се използва функцията за запълнен пик, в набора от данни все още има много стойности на интензитета „0“, които ще повлияят на изчислението на корелацията. След това сравняваме резултатите от обработката на данните, получени когато се използва функцията за запълнен пик и когато функцията за запълнен пик не се използва, и изчисляваме стойността на фоновия шум въз основа на средната коригирана оценена стойност, след което заместваме тези 0 стойности на интензитета с изчислената фонова стойност. Също така разглеждаме само характеристики, чийто интензитет надвишава три пъти фоновата стойност, и ги считаме за „истински пикове“. За PCC изчисления се разглеждат само m/z сигналите на наборите от данни за прекурсора на пробата (MS1) и фрагмента с поне осем истински пика.
Ако интензитетът на характеристиката за качество на прекурсора в цялата проба е значително корелиран с намаления интензитет на същата характеристика за качество, която е подложена на ниска или висока енергия на сблъсък, и характеристиката не е маркирана като изотопен пик от CAMERA, тя може да бъде допълнително дефинирана. След това, чрез изчисляване на всички възможни двойки прекурсор-продукт в рамките на 3 s (очакваният прозорец за време на задържане за задържане на пика), се извършва корелационен анализ. Само когато стойността m/z е по-ниска от стойността на прекурсора и MS/MS фрагментацията се случи на същото място в пробата в набора от данни като прекурсора, от който е получена, тя се счита за фрагмент.
Въз основа на тези две прости правила, ние изключваме посочените фрагменти със стойности на m/z, по-големи от m/z на идентифицирания прекурсор, и въз основа на позицията на пробата, където се появява прекурсорът, и посочения фрагмент. Възможно е също така да се изберат качествените характеристики, генерирани от много фрагменти в източника, генерирани в режим MS1, като кандидат-прекурсори, като по този начин се генерират излишни MS/MS съединения. За да се намали тази излишност на данни, ако сходството на NDP на спектрите надвишава 0.6 и те принадлежат към хроматограмата „pcgroup“, анотирана от CAMERA, ще ги обединим. Накрая, ние обединяваме всичките четири CE резултата, свързани с прекурсора и фрагментите, в крайния деконволюиран композитен спектър, като избираме пика с най-висок интензитет сред всички кандидат-пикове със същата m/z стойност при различни енергии на сблъсък. Последващите стъпки на обработка се основават на концепцията за композитен спектър и отчитат различните CE условия, необходими за максимизиране на вероятността от фрагментация, тъй като някои фрагменти могат да бъдат открити само при специфична енергия на сблъсък.
RDPI (30) беше използван за изчисляване на индуцируемостта на метаболитния профил. Разнообразието на метаболитния спектър (Hj индекс) се получава от изобилието на MS/MS прекурсори, използвайки ентропията на Шанън на честотното разпределение на MS/MS, използвайки следното уравнение, описано от Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij), където Pij съответства на относителната честота на i-тата MS/MS в j-тата проба (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Метаболитната специфичност (Si индекс) се определя като идентичността на експресията на дадена MS/MS спрямо честотата между разглежданите проби. MS/MS специфичността се изчислява като Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Използвайте следната формула, за да измерите специфичния за метаболома δj индекс на всяка j-та проба и средната стойност на MS/MS специфичността δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS спектрите са подравнени по двойки и сходството се изчислява въз основа на двата резултата. Първо, използвайки стандартен NDP (известен също като метод на косинусна корелация), използвайте следното уравнение, за да оцените сходството на сегментите между спектрите: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 където S1 и S2 Съответно, за спектър 1 и спектър 2, както и за WS1, i и WS2, i представлява теглото, базирано на интензитета на пика, при което разликата на i-тия общ пик между двата спектъра е по-малка от 0,01 Da. Теглото се изчислява, както следва: W = [интензитет на пика] m [качество] n, m = 0,5, n = 2, както е предложено от MassBank.
Беше внедрен втори метод за оценяване, който включваше анализ на споделената NL между MS/MS. За тази цел използвахме 52 NL списъка, често срещани по време на процеса на фрагментиране на MS, едновременно, и по-специфичната NL (файл с данни S1), която преди това беше анотирана за MS/MS спектъра на вторичните метаболити на отслабения вид Nepenthes (9, 26). Създайте двоичен вектор от 1 и 0 за всяка MS/MS, съответстващ съответно на текущата и несъществуващата на някоя NL. Въз основа на сходството на евклидовото разстояние, резултатът за NL сходство се изчислява за всяка двойка двоични NL вектори.
За да извършим двойно клъстериране, използвахме R пакета DiffCoEx, който е базиран на разширение на Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA). Използвайки NDP и NL матриците за оценяване на MS/MS спектрите, използвахме DiffCoEx за изчисляване на сравнителната корелационна матрица. Бинарното клъстериране се извършва чрез задаване на параметъра „cutreeDynamic“ на method = „hybrid“, cutHeight = 0.9999, deepSplit = T и minClusterSize = 10. R изходният код на DiffCoEx беше изтеглен от допълнителен файл 1 от Tesson et al. (57); Необходимият софтуерен пакет R WGCNA може да бъде намерен на https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
За да извършим MS/MS молекулярен мрежов анализ, изчислихме сдвоена спектрална свързаност въз основа на типовете сходство NDP и NL и използвахме софтуера Cytoscape за визуализиране на мрежовата топология, използвайки органично оформление в приложението за разширение на алгоритъма за оформление CyFilescape yFiles.
Използвайте R версия 3.0.1 за извършване на статистически анализ на данните. Статистическата значимост беше оценена с помощта на двуфакторен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от post-hoc тест на Tukey за честно значима разлика (HSD). За да се анализира разликата между третирането с тревопасни животни и контролата, двустранното разпределение на двете групи проби с еднаква дисперсия беше анализирано с помощта на t-тест на Стюдънт.
За допълнителни материали към тази статия, моля, вижте http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Това е статия с отворен достъп, разпространявана съгласно условията на Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, който позволява използването, разпространението и възпроизвеждането във всякакъв носител, стига крайната употреба да не е за търговска печалба и предпоставката е, че оригиналното произведение е коректно. Справка.
Забележка: Молим ви да предоставите имейл адреса си само за да знае човекът, когото препоръчвате на страницата, че искате да види имейла и че не е спам. Няма да събираме никакви имейл адреси.
Този въпрос се използва, за да се провери дали сте посетител и да се предотврати автоматичното изпращане на спам.
Теорията на информацията предоставя универсална валута за сравнение на специални метаболоми и предсказване на теории за тестова защита.
Теорията на информацията предоставя универсална валута за сравнение на специални метаболоми и предсказване на теории за тестова защита.
©2021 Американска асоциация за напредък на науката. всички права запазени. AAAS е партньор на HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.