Статията е част от изследователската тема „Повишаване на устойчивостта на бобовите растения към патогени и вредители“, вижте всички 5 статии
Причинителят на гъбичната болест по растенията некроза Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary използва многостепенна стратегия за заразяване на различни растения гостоприемници. Това проучване предлага използването на диамин L-орнитин, непротеинова аминокиселина, която стимулира синтеза на други есенциални аминокиселини, като алтернативна стратегия за управление за подобряване на молекулярните, физиологичните и биохимичните реакции на Phaseolus vulgaris L. към бялата плесен, причинена от Pseudomonas sclerotiorum. In vitro експерименти показват, че L-орнитинът значително инхибира мицелния растеж на S. pyrenoidosa по дозозависим начин. Освен това, той може значително да намали тежестта на бялата плесен в оранжерийни условия. Освен това, L-орнитинът стимулира растежа на третираните растения, което показва, че тестваните концентрации на L-орнитин не са фитотоксични за третираните растения. В допълнение, L-орнитинът засилва експресията на неензимни антиоксиданти (общо разтворими феноли и флавоноиди) и ензимни антиоксиданти (каталаза (CAT), пероксидаза (POX) и полифенолоксидаза (PPO)) и увеличава експресията на три гена, свързани с антиоксидантите (PvCAT1, PvSOD и PvGR). Освен това, in silico анализът разкрива наличието на предполагаем оксалоацетат ацетилхидролазен (SsOAH) протеин в генома на S. sclerotiorum, който е много подобен на оксалоацетат ацетилхидролазен (SsOAH) протеините на Aspergillus fijiensis (AfOAH) и Penicillium sp. (PlOAH) по отношение на функционален анализ, консервативни домени и топология. Интересно е, че добавянето на L-орнитин към среда от картофено-декстрозен бульон (PDB) значително намалява експресията на SsOAH гена в мицела на S. sclerotiorum. По подобен начин, екзогенното приложение на L-орнитин значително намали експресията на SsOAH гена в гъбични мицели, събрани от третирани растения. Накрая, приложението на L-орнитин значително намали секрецията на оксалова киселина както в PDB среда, така и в заразените листа. В заключение, L-орнитинът играе ключова роля за поддържане на редокс статуса, както и засилване на защитния отговор на заразените растения. Резултатите от това проучване могат да помогнат за разработването на иновативни, екологично чисти методи за контрол на бялата плесен и смекчаване на нейното въздействие върху производството на боб и други култури.
Бялата плесен, причинена от некротрофната гъба Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, е опустошително, намаляващо добива заболяване, което представлява сериозна заплаха за световното производство на боб (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum е един от най-трудните за контролиране почвени гъбни растителни патогени, с широк спектър от гостоприемници от над 600 растителни вида и способността бързо да мацерира тъканите на гостоприемника по неспецифичен начин (Liang and Rollins, 2018). При неблагоприятни условия тя преминава през критична фаза от жизнения си цикъл, като остава в латентно състояние за дълги периоди от време като черни, твърди, подобни на семена структури, наречени „склероции“ в почвата, или като бели, пухкави израстъци в мицела или сърцевината на стъблото на заразените растения (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum е способен да образува склероции, което му позволява да оцелява в заразените полета за дълги периоди от време и да персистира по време на заболяването (Schwartz et al., 2005). Склероциите са богати на хранителни вещества, могат да персистират в почвата за дълги периоди и служат като основен инокулум за последващи инфекции (Schwartz et al., 2005). При благоприятни условия склероциите покълват и произвеждат спори, разпространявани във въздуха, които могат да заразят всички надземни части на растението, включително, но не само, цветове, стъбла или шушулки (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum използва многостепенна стратегия за заразяване на растенията гостоприемници, включваща серия от координирани събития - от поникване на склероциите до развитие на симптоми. Първоначално S. sclerotiorum произвежда суспендирани спори (наречени аскоспори) от гъбоподобни структури, наречени апотеции, които се пренасят във въздуха и се развиват в неподвижни склероции върху заразените растителни остатъци (Bolton et al., 2006). След това гъбата отделя оксалова киселина, фактор на вирулентност, за да контролира pH на клетъчната стена на растението, да насърчи ензимното разграждане и инвазията на тъканите (Hegedus and Rimmer, 2005) и да потисне оксидативния взрив на растението гостоприемник. Този процес на подкиселяване отслабва клетъчната стена на растението, осигурявайки благоприятна среда за нормалното и ефективно действие на ензимите, разграждащи клетъчната стена на гъбичките (CWDEs), позволявайки на патогена да преодолее физическата бариера и да проникне в тъканите на гостоприемника (Marciano et al., 1983). След проникване, S. sclerotiorum секретира редица CWDEs, като полигалактуроназа и целулаза, които улесняват разпространението му в заразените тъкани и причиняват тъканна некроза. Прогресията на лезиите и хифните подложки води до характерните симптоми на бяла плесен (Hegedus and Rimmer, 2005). Междувременно, растенията гостоприемници разпознават свързани с патогени молекулярни модели (PAMPs) чрез рецептори за разпознаване на модели (PRRs), задействайки серия от сигнални събития, които в крайна сметка активират защитните реакции.
Въпреки десетилетията усилия за контрол на болестите, недостигът на адекватна резистентна зародишна плазма остава при боба, както и при други търговски култури, поради резистентността, оцеляването и адаптивността на патогена. Следователно, управлението на болестите е изключително трудно и изисква интегрирана, многостранна стратегия, която включва комбинация от културни практики, биологичен контрол и химически фунгициди (O'Sullivan et al., 2021). Химичният контрол на бялата плесен е най-ефективен, защото фунгицидите, когато се прилагат правилно и в точното време, могат ефективно да контролират разпространението на болестта, да намалят тежестта на инфекцията и да сведат до минимум загубите на добив. Прекомерната употреба и прекомерното разчитане на фунгициди обаче може да доведе до появата на резистентни щамове на S. sclerotiorum и да повлияе негативно на нецелевите организми, здравето на почвата и качеството на водата (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Следователно, намирането на екологично чисти алтернативи се е превърнало в основен приоритет.
Полиамините (PAs), като путресцин, спермидин, спермин и кадаверин, могат да служат като обещаващи алтернативи срещу почвените растителни патогени, като по този начин напълно или частично намаляват употребата на опасни химични фунгициди (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). При висшите растения PAs участват в много физиологични процеси, включително, но не само, клетъчно делене, диференциация и реакция на абиотични и биотични стресове (Killiny and Nehela, 2020). Те могат да действат като антиоксиданти, да помагат за улавянето на реактивни кислородни видове (ROS), да поддържат редокс хомеостазата (Nehela and Killiny, 2023), да индуцират гени, свързани със защитата (Romero et al., 2018), да регулират различни метаболитни пътища (Nehela and Killiny, 2023), да модулират ендогенни фитохормони (Nehela and Killiny, 2019), да установят системна придобита резистентност (SAR) и да регулират взаимодействията между растенията и патогените (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Заслужава да се отбележи, че специфичните механизми и роли на PAs в растителната защита варират в зависимост от растителните видове, патогените и условията на околната среда. Най-разпространената PA в растенията се биосинтезира от есенциалния полиамин L-орнитин (Killiny and Nehela, 2020).
L-орнитинът играе множество роли в растежа и развитието на растенията. Например, предишни проучвания показват, че при ориза (Oryza sativa), орнитинът може да е свързан с рециклирането на азот (Liu et al., 2018), добива, качеството и аромата на ориза (Lu et al., 2020) и реакцията на воден стрес (Yang et al., 2000). Освен това, екзогенното приложение на L-орнитин значително повишава устойчивостта на засушаване при захарното цвекло (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) и облекчава солевия стрес при растенията лук (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu and Çavuşoǧlu, 2021) и кашу (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Потенциалната роля на L-орнитина в защитата от абиотичен стрес може да се дължи на участието му в натрупването на пролин в третираните растения. Например, гени, свързани с метаболизма на пролин, като гените за орнитин делта аминотрансфераза (делта-OAT) и пролин дехидрогеназа (ProDH1 и ProDH2), са били докладвани по-рано, че участват в защитата на Nicotiana benthamiana и Arabidopsis thaliana срещу щамове Pseudomonas syringae, които не са гостоприемници (Senthil-Kumar and Mysore, 2012). От друга страна, гъбичната орнитин декарбоксилаза (ODC) е необходима за растежа на патогените (Singh et al., 2020). Насочването към ODC на Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici чрез индуцирано от гостоприемника генно заглушаване (HIGS) значително повишава устойчивостта на доматените растения към Fusarium wilt (Singh et al., 2020). Потенциалната роля на екзогенното приложение на орнитин срещу биотични стресове като фитопатогени обаче не е добре проучена. По-важното е, че ефектите на орнитина върху устойчивостта на болести и свързаните с тях биохимични и физиологични явления остават до голяма степен неизследвани.
Разбирането на сложността на инфекцията на бобовите растения с S. sclerotiorum е важно за разработването на ефективни стратегии за контрол. В това проучване ние си поставихме за цел да идентифицираме потенциалната роля на диамин L-орнитин като ключов фактор за засилване на защитните механизми и устойчивостта на бобовите растения към инфекция със Sclerotinia sclerotiorum. Предполагаме, че освен че засилва защитните реакции на заразените растения, L-орнитинът играе ключова роля и за поддържане на редокс статуса. Предполагаме, че потенциалните ефекти на L-орнитина са свързани с регулирането на ензимните и неензимните антиоксидантни защитни механизми и интерференцията с гъбичните патогенни/вирулентни фактори и свързаните с тях протеини. Тази двойна функционалност на L-орнитина го прави обещаващ кандидат за устойчива стратегия за смекчаване на въздействието на бялата плесен и повишаване на устойчивостта на обикновените бобови култури към този мощен гъбичен патоген. Резултатите от настоящото проучване могат да помогнат за разработването на иновативни, екологично чисти методи за контрол на бялата плесен и смекчаване на нейното въздействие върху производството на бобови растения.
В това проучване като експериментален материал е използван чувствителен търговски сорт обикновен фасул, Гиза 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Здрави семена са любезно предоставени от отдела за изследване на бобови растения, Института за изследване на полските култури (FCRI), Центъра за селскостопански изследвания (ARC), Египет. Пет семена са засети в пластмасови саксии (вътрешен диаметър 35 см, дълбочина 50 см), пълни с почва, заразена с S. sclerotiorum, при оранжерийни условия (25 ± 2 °C, относителна влажност 75 ± 1%, 8 часа светлина/16 часа тъмнина). На 7–10 дни след засяването (DPS), разсадът е прореден, за да останат само два разсада с равномерен растеж и три напълно развити листа във всяка саксия. Всички саксийни растения са поливани веднъж на всеки две седмици и са торени месечно с препоръчителната доза за дадения сорт.
За да се приготви L-орнитиндиамин (известен също като (+)-(S)-2,5-диаминопентанова киселина; Sigma-Aldrich, Дармщат, Германия) с концентрация от 500 mg/L, 50 mg първо се разтварят в 100 mL стерилна дестилирана вода. След това основният разтвор се разрежда и се използва в последващи експерименти. Накратко, шест серии от концентрации на L-орнитин (12,5, 25, 50, 75, 100 и 125 mg/L) са тествани in vitro. Освен това, стерилна дестилирана вода е използвана като отрицателна контрола (Mock), а търговският фунгицид „Rizolex-T“ 50% омокрящ се прах (токлофос-метил 20% + тирам 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, провинция Гарбия, Египет) е използван като положителна контрола. Търговският фунгицид „Rizolex-T“ е тестван in vitro в пет концентрации (2, 4, 6, 8 и 10 mg/L).
Проби от стъбла и шушулки на обикновен фасул, показващи типични симптоми на бяла плесен (процент на заразяване: 10–30%), бяха събрани от търговски ферми. Въпреки че повечето от заразените растителни материали бяха идентифицирани по вид/сорт (чувствителен търговски сорт Giza 3), други, особено тези, получени от местни пазари, бяха от неизвестен вид. Събраните заразени материали първо бяха повърхностно дезинфекцирани с 0,5% разтвор на натриев хипохлорит в продължение на 3 минути, след което бяха изплакнати няколко пъти със стерилна дестилирана вода и подсушени със стерилна филтърна хартия, за да се отстрани излишната вода. Заразените органи след това бяха нарязани на малки парченца от средната тъкан (между здравите и заразените тъкани), култивирани върху среда от картофено-декстрозен агар (PDA) и инкубирани при 25 ± 2 °C с 12-часов цикъл светлина/12-часова тъмнина в продължение на 5 дни, за да се стимулира образуването на склероции. Методът на мицелния връх също беше използван за пречистване на гъбични изолати от смесени или замърсени култури. Пречистеният гъбичен изолат първоначално беше идентифициран въз основа на неговите културни морфологични характеристики и след това беше потвърдено, че е S. sclerotiorum въз основа на микроскопски характеристики. Накрая, всички пречистени изолати бяха тествани за патогенност върху чувствителния сорт обикновен фасул Giza 3, за да отговарят на постулатите на Кох.
В допълнение, най-инвазивният изолат на S. sclerotiorum (изолат №3) беше допълнително потвърден въз основа на секвениране с вътрешен транскрибиран спейсър (ITS), както е описано от White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Накратко, изолатите бяха култивирани в картофено-декстрозен бульон (PDB) и инкубирани при 25 ± 2 °C в продължение на 5–7 дни. След това гъбичният мицел беше събран, филтриран през тензух, промит два пъти със стерилна вода и изсушен със стерилна филтърна хартия. Геномна ДНК беше изолирана с помощта на Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). След това ITS рДНК регионът беше амплифициран с помощта на специфичната двойка праймери ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; очакван размер: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Пречистените PCR продукти бяха представени за секвениране (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS рДНК секвенциите бяха секвенирани двупосочно, използвайки метода на секвениране на Sanger. Сглобените заявени секвенции след това бяха сравнени с най-новите данни в GenBank и Националния център за биотехнологична информация (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/), използвайки софтуера BLASTn. Заявената последователност беше сравнена с 20 други щама/изолати на S. sclerotiorum, извлечени от най-новите данни в NCBI GenBank (Допълнителна таблица S1), използвайки ClustalW в пакета за молекулярно-еволюционен генетичен анализ (MEGA-11; версия 11) (Kumar et al., 2024). Еволюционният анализ беше извършен с помощта на метода на максималната вероятност и общия модел на обратимо във времето нуклеотидно заместване (Nei and Kumar, 2000). Показано е дървото с най-висока логаритмична вероятност. Първоначалното дърво за евристичното търсене се избира чрез избиране на дървото с по-висока логаритмична вероятност между дървото за свързване на непосредствени съседства (NJ) (Kumar et al., 2024) и дървото за максимална пестеливост (MP). NJ дървото беше конструирано с помощта на матрица на двойките разстояния, изчислена с помощта на общия модел за обратимо във времето (Nei and Kumar, 2000).
Антибактериалната активност на L-орнитин и бактерицида „Rizolex-T“ беше определена in vitro чрез метода на агар-дифузия. Метод: Взема се подходящо количество от основния разтвор на L-орнитин (500 mg/L) и се смесва добре с 10 ml от хранителната среда PDA, за да се приготвят разтвори с крайни концентрации съответно 12,5, 25, 50, 75, 100 и 125 mg/L. Пет концентрации на фунгицида „Rizolex-T“ (2, 4, 6, 8 и 10 mg/L) и стерилна дестилирана вода бяха използвани като контрола. След втвърдяване на средата, прясно приготвена мицелна тапа от култура Sclerotinia sclerotiorum с диаметър 4 mm беше пренесена в центъра на петриевата паничка и култивирана при 25±2°C, докато мицелът покрие цялата контролна петриева паничка, след което беше регистриран растежът на гъбичките. Изчислете процентното инхибиране на радиалния растеж на S. sclerotiorum, като използвате уравнение 1:
Експериментът беше повторен два пъти, с шест биологични повторения за всяка контролна/експериментална група и пет саксии (по две растения на саксия) за всяко биологично повторение. Всяко биологично повторение беше анализирано два пъти (две технически повторения), за да се гарантира точността, надеждността и възпроизводимостта на експерименталните резултати. Освен това беше използван пробит-регресионен анализ за изчисляване на полумаксималната инхибираща концентрация (IC50) и IC99 (Prentice, 1976).
За да се оцени потенциалът на L-орнитин в оранжерийни условия, бяха проведени два последователни експеримента в саксии. Накратко, саксиите бяха напълнени със стерилизирана глинесто-пясъчна почва (3:1) и инокулирани с прясно приготвена култура от S. sclerotiorum. Първо, най-инвазивният изолат на S. sclerotiorum (изолат №3) беше култивиран чрез разрязване на един склероций наполовина, поставяне с лицето надолу върху PDA и инкубиране при 25°C в постоянна тъмнина (24 часа) в продължение на 4 дни, за да се стимулира растежът на мицела. След това бяха взети четири агарови тампона с диаметър 5 mm от водещия ръб и инокулирани със 100 g стерилна смес от пшенични и оризови трици (1:1, v/v) и всички колби бяха инкубирани при 25 ± 2°C при 12-часов цикъл светлина/12 часа тъмнина в продължение на 5 дни, за да се стимулира образуването на склероции. Съдържанието на всички колби беше добре разбъркано, за да се осигури хомогенност преди добавяне на почвата. След това във всяка саксия бяха добавени 100 г от колонизиращата смес от трици, за да се осигури постоянна концентрация на патогени. Инокулираните саксии бяха полети, за да се активира растежът на гъбичките, и поставени в оранжерийни условия за 7 дни.
След това във всяка саксия бяха засети пет семена от сорта Giza 3. За саксиите, третирани с L-орнитин и фунгицида Rizolex-T, стерилизираните семена първо бяха накиснати за два часа във воден разтвор на двете съединения с крайна концентрация на IC99 от около 250 mg/L и 50 mg/L, съответно, и след това изсушени на въздух за един час преди сеитба. От друга страна, семената бяха накиснати в стерилна дестилирана вода като отрицателна контрола. След 10 дни, преди първото поливане, разсадът беше прореден, оставяйки само два чисти разсада във всяка саксия. Освен това, за да се осигури инфекция с S. sclerotiorum, стъблата на бобовите растения в един и същи стадий на развитие (10 дни) бяха отрязани на две различни места с помощта на стерилизиран скалпел и приблизително 0,5 g от колонизиращата смес от трици беше поставена във всяка рана, последвано от висока влажност, за да се стимулира инфекцията и развитието на болестта във всички инокулирани растения. Контролните растения бяха наранени по подобен начин и в раната беше поставено равно количество (0,5 g) стерилна, неколонизирана смес от трици и поддържано при висока влажност, за да се симулира средата за развитие на болестта и да се осигури съгласуваност между третираните групи.
Метод на третиране: Разсадът от боб се полива с 500 ml воден разтвор на L-орнитин (250 mg/l) или фунгицида Rizolex-T (50 mg/l) чрез напояване на почвата, след което третирането се повтаря три пъти през интервал от 10 дни. Контролните групи, третирани с плацебо, се напояват с 500 ml стерилна дестилирана вода. Всички третирания се провеждат при оранжерийни условия (25 ± 2°C, 75 ± 1% относителна влажност и фотопериод от 8 часа светлина/16 часа тъмнина). Всички саксии се поливат на всеки две седмици и се третират месечно с балансиран NPK тор (20-20-20, с 3,6% сяра и TE микроелементи; Zain Seeds, Египет) в концентрация 3–4 g/l чрез листно пръскане съгласно препоръките за конкретния сорт и инструкциите на производителя. Освен ако не е посочено друго, напълно разрасналите се зрели листа (2-ри и 3-ти лист отгоре) са събрани от всяка биологична реплика 72 часа след третирането (hpt), хомогенизирани, обединени и съхранявани при -80°C за по-нататъшни анализи, включително, но не само, in situ хистохимична локализация на индикатори за оксидативен стрес, липидна пероксидация, ензимни и неензимни антиоксиданти и генна експресия.
Интензитетът на инфекцията с бяла плесен е оценяван ежеседмично 21 дни след инокулацията (dpi), използвайки скала от 1 до 9 (Допълнителна таблица S2), базирана на скалата на Petzoldt и Dickson (1996), модифицирана от Teran et al. (2006). Накратко, стъблата и клоните на бобовите растения са изследвани, започвайки от точката на инокулация, за да се проследи прогресията на лезиите по междувъзлията и възлите. След това е измерено разстоянието на лезията от точката на инокулация до най-отдалечената точка по стъблото или клона и е присвоен резултат от 1 до 9 въз основа на местоположението на лезията, където (1) показва липса на видима инфекция близо до точката на инокулация, а (2–9) показва постепенно увеличаване на размера на лезията и прогресия по възлите/междувъзлията (Допълнителна таблица S2). Интензитетът на инфекцията с бяла плесен след това е преобразуван в проценти, използвайки формула 2:
Освен това, площта под кривата на прогресията на заболяването (AUDPC) беше изчислена по формулата (Shaner and Finney, 1977), която наскоро беше адаптирана за бяло гниене на обикновения фасул (Chauhan et al., 2020), използвайки уравнение 3:
Където Yi = тежестта на заболяването към момент ti, Yi+1 = тежестта на заболяването към следващия момент ti+1, ti = времето на първото измерване (в дни), ti+1 = времето на следващото измерване (в дни), n = общ брой времеви точки или точки на наблюдение. Параметрите на растежа на бобените растения, включително височината на растението (см), броя на клоните на растението и броя на листата на растението, са записвани ежеседмично в продължение на 21 дни във всички биологични повторения.
Във всяка биологична реплика, проби от листа (втори и трети напълно развит лист от върха) бяха събрани на 45-ия ден след третирането (15 дни след последното третиране). Всяка биологична реплика се състоеше от пет саксии (по две растения на саксия). Около 500 mg от раздробената тъкан беше използвана за екстракция на фотосинтетични пигменти (хлорофил a, хлорофил b и каротеноиди), използвайки 80% ацетон при 4°C на тъмно. След 24 часа пробите бяха центрофугирани и супернатантът беше събран за колориметрично определяне на съдържанието на хлорофил a, хлорофил b и каротеноиди, използвайки UV-160A спектрофотометър (Shimadzu Corporation, Япония) съгласно метода на (Lichtenthaler, 1987) чрез измерване на абсорбцията при три различни дължини на вълната (A470, A646 и A663 nm). Накрая, съдържанието на фотосинтетични пигменти беше изчислено, използвайки следните формули 4–6, описани от Lichtenthaler (1987).
72-ия час след третирането (hpt), листата (вторият и третият напълно развит лист отгоре) бяха събрани от всяко биологично повторение за in situ хистохимична локализация на водороден пероксид (H2O2) и супероксиден анион (O2•−). Всяко биологично повторение се състоеше от пет саксии (две растения на саксия). Всяко биологично повторение беше анализирано в два екземпляра (две технически повторения), за да се гарантира точността, надеждността и възпроизводимостта на метода. H2O2 и O2•− бяха определени съответно с помощта на 0,1% 3,3′-диаминобензидин (DAB; Sigma-Aldrich, Дармщат, Германия) или нитросин тетразолий (NBT; Sigma-Aldrich, Дармщат, Германия), следвайки методите, описани от Romero-Puertas et al. (2004) и Adam et al. (1989) с малки модификации. За хистохимична локализация на H2O2 in situ, листенцата бяха вакуумно инфилтрирани с 0,1% DAB в 10 mM Tris буфер (pH 7,8) и след това инкубирани при стайна температура на светлина в продължение на 60 минути. Листенцата бяха избелени в 0,15% (v/v) TCA в 4:1 (v/v) етанол:хлороформ (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Кайро, Египет) и след това изложени на светлина, докато потъмнеят. По подобен начин, клапите бяха вакуумно инфилтрирани с 10 mM калиево-фосфатен буфер (pH 7,8), съдържащ 0,1 w/v % HBT за хистохимична локализация на O2•− in situ. Листенцата бяха инкубирани на светлина при стайна температура в продължение на 20 минути, след това избелени както по-горе и след това осветени, докато се появят тъмносини/виолетови петна. Интензитетът на получения кафяв (като индикатор H2O2) или синьо-виолетов (като индикатор O2•−) цвят беше оценен с помощта на версията Fiji на пакета за обработка на изображения ImageJ (http://fiji.sc; достъп на 7 март 2024 г.).
Малондиалдехидът (MDA; като маркер на липидна пероксидация) беше определен съгласно метода на Du и Bramlage (1992) с леки модификации. Листата от всяка биологична реплика (втори и трети напълно развит лист отгоре) бяха събрани 72 часа след третирането (hpt). Всяка биологична реплика включваше пет саксии (две растения на саксия). Всяка биологична реплика беше анализирана в два екземпляра (две технически реплики), за да се гарантира точността, надеждността и възпроизводимостта на метода. Накратко, 0,5 g смляна листна тъкан беше използвана за екстракция на MDA с 20% трихлороцетна киселина (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA), съдържаща 0,01% бутилиран хидрокситолуен (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Съдържанието на MDA в супернатантата след това беше определено колориметрично чрез измерване на абсорбцията при 532 и 600 nm, използвайки UV-160A спектрофотометър (Shimadzu Corporation, Япония), и след това изразено като nmol g−1 FW.
За оценка на неензимни и ензимни антиоксиданти, листа (втори и трети напълно развит лист отгоре) бяха събрани от всяка биологична реплика 72 часа след третирането (hpt). Всяка биологична реплика се състоеше от пет саксии (по две растения на саксия). Всяка биологична проба беше анализирана в два екземпляра (две технически проби). Два листа бяха смлени с течен азот и използвани директно за определяне на ензимни и неензимни антиоксиданти, общи аминокиселини, съдържание на пролин, генна експресия и количествено определяне на оксалат.
Общите разтворими феноли бяха определени с помощта на реагент Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) с леки модификации на метода, описан от Kahkonen et al. (1999). Накратко, приблизително 0,1 g хомогенизирана листна тъкан беше екстрахирана с 20 ml 80% метанол на тъмно в продължение на 24 часа и супернатантата беше събрана след центрофугиране. 0,1 ml от екстракта на пробата бяха смесени с 0,5 ml реагент Folin-Ciocalteu (10%), разклатени в продължение на 30 секунди и оставени на тъмно за 5 минути. След това към всяка епруветка бяха добавени 0,5 ml 20% разтвор на натриев карбонат (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Кайро, Египет), разбъркани добре и инкубирани при стайна температура на тъмно в продължение на 1 час. След инкубацията, абсорбцията на реакционната смес беше измерена при 765 nm с помощта на UV-160A спектрофотометър (Shimadzu Corporation, Япония). Концентрацията на общите разтворими феноли в екстрактите от пробите беше определена с помощта на калибровъчна крива за галова киселина (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) и изразена като милиграми еквивалент на галова киселина на грам прясно тегло (mg GAE g-1 прясно тегло).
Общото съдържание на разтворими флавоноиди беше определено съгласно метода на Djeridane et al. (2006) с леки модификации. Накратко, 0,3 ml от горния метанолов екстракт беше смесен с 0,3 ml 5% разтвор на алуминиев хлорид (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), енергично разбъркан и след това инкубиран при стайна температура в продължение на 5 минути, последвано от добавяне на 0,3 ml 10% разтвор на калиев ацетат (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt), добре разбъркан и инкубиран при стайна температура в продължение на 30 минути на тъмно. След инкубацията, абсорбцията на реакционната смес беше измерена при 430 nm с помощта на UV-160A спектрофотометър (Shimadzu Corporation, Japan). Концентрацията на общите разтворими флавоноиди в екстрактите от пробите беше определена с помощта на калибровъчна крива на рутин (TCI America, Portland, OR, USA) и след това изразена като милиграми рутинов еквивалент на грам прясно тегло (mg RE g-1 прясно тегло).
Общото съдържание на свободни аминокиселини в листата на боба беше определено с помощта на модифициран нинхидринов реагент (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA), базиран на метода, предложен от Yokoyama и Hiramatsu (2003) и модифициран от Sun et al. (2006). Накратко, 0,1 g смляна тъкан беше екстрахирана с буфер с pH 5,4 и 200 μL от супернатанта реагираха с 200 μL нинхидрин (2%) и 200 μL пиридин (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), инкубираха се във вряща водна баня в продължение на 30 минути, след което се охлаждаха и измерваха при 580 nm, използвайки UV-160A спектрофотометър (Shimadzu Corporation, Japan). От друга страна, пролинът беше определен по метода на Bates (Bates et al., 1973). Пролинът се екстрахира с 3% сулфосалицилова киселина (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) и след центрофугиране, 0,5 ml от супернатантата се смесват с 1 ml ледена оцетна киселина (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) и нинхидринов реагент, инкубира се при 90°C за 45 минути, охлажда се и се измерва при 520 nm, като се използва същият спектрофотометър, както по-горе. Общите свободни аминокиселини и пролин в листните екстракти се определят съответно с помощта на калибровъчни криви на глицин и пролин (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) и се изразяват като mg/g прясно тегло.
За да се определи ензимната активност на антиоксидантните ензими, приблизително 500 mg хомогенизирана тъкан беше екстрахирана с 3 ml 50 mM Tris буфер (pH 7.8), съдържащ 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) и 7.5% поливинилпиролидон (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), центрофугирана при 10 000 × g за 20 минути в хладилник (4 °C) и супернатантата (суров ензимен екстракт) беше събрана (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Каталазата (CAT) след това реагира с 2 ml 0,1 M натриев фосфатен буфер (pH 6,5; Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) и 100 μl 269 mM разтвор на H2O2, за да се определи ензимната ѝ активност съгласно метода на Aebi (1984) с леки модификации (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Ензимната активност на гваякол-зависимата пероксидаза (POX) е определена по метода на Harrach et al. (2009). (2008) с малки модификации (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) и ензимната активност на полифенолоксидазата (PPO) беше определена след реакция с 2,2 ml 100 mM натриев фосфатен буфер (pH 6,0), 100 μl гваякол (TCI chemicals, Портланд, Орегон, САЩ) и 100 μl 12 mM H2O2. Методът беше леко модифициран от (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Анализът беше извършен след реакция с 3 ml разтвор на катехол (Thermo Scientific Chemicals, Уолтъм, Масачузетс, САЩ) (0,01 M), прясно приготвен в 0,1 M фосфатен буфер (pH 6,0). CAT активността беше измерена чрез наблюдение на разлагането на H2O2 при 240 nm (A240), POX активността беше измерена чрез наблюдение на увеличението на абсорбцията при 436 nm (A436), а PPO активността беше измерена чрез записване на флуктуациите на абсорбцията при 495 nm (A495) на всеки 30 s в продължение на 3 min, използвайки UV-160A спектрофотометър (Shimadzu, Япония).
За откриване на нивата на транскриптите на три гена, свързани с антиоксиданти, включително пероксизомна каталаза (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), супероксид дисмутаза (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1) и глутатион редуктаза (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1) в листа от боб (вторият и третият напълно развит лист отгоре) 72 часа след последното третиране, беше използвана RT-PCR в реално време. Накратко, РНК беше изолирана с помощта на Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Китай) съгласно протокола на производителя. След това, кДНК беше синтезирана с помощта на TOP script™ cDNA Synthesis Kit съгласно инструкциите на производителя. Праймерните последователности на горните три гена са изброени в Допълнителна таблица S3. PvActin-3 (номер в GenBank за достъп: XM_068616709.1) беше използван като ген за управление, а относителната генна експресия беше изчислена с помощта на метода 2-ΔΔCT (Livak and Schmittgen, 2001). Демонстрирана беше стабилност на актина при биотичен стрес (несъвместимо взаимодействие между обикновените бобови растения и антракнозната гъба Colletotrichum lindemuthianum) и абиотичен стрес (суша, соленост, ниска температура) (Borges et al., 2012).
Първоначално извършихме in silico анализ в целия геном на оксалоацетат ацетилхидролаза (OAH) протеини в S. sclerotiorum, използвайки инструмента protein-protein BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Накратко, използвахме OAH от Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; таксид: 1191702; GenBank accession number XP_040799428.1; 342 аминокиселини) и Penicillium lagena (PlOAH; таксид: 94218; GenBank accession number XP_056833920.1; 316 аминокиселини) като заявъчни последователности за картографиране на хомоложния протеин в S. sclerotiorum (таксид: 5180). BLASTp беше извършен спрямо най-скоро наличните данни за генома на S. sclerotiorum в GenBank на уебсайта на Националния център за биотехнологична информация (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
В допълнение, предсказаният OAH ген от S. sclerotiorum (SsOAH) и еволюционният анализ и филогенетичното дърво на AfOAH от A. fijiensis CBS 313.89 и PlOAH от P. lagena бяха изведени с помощта на метода на максималната вероятност в MEGA11 (Tamura et al., 2021) и JTT матрично-базирания модел (Jones et al., 1992). Филогенетичното дърво беше комбинирано с анализ на множественото подравняване на протеинови последователности на всички предсказани OAH гени (SsOAH) от S. sclerotiorum и заявената последователност, използвайки инструмента за подравняване, базирано на ограничения (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, 2007). В допълнение, най-добре съвпадащите аминокиселинни последователности на SsOAH от S. sclerotiorum бяха подравнени със заявените последователности (AfOAH и PlOAH) (Larkin et al., 2007), използвайки ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), а запазените региони в подравняването бяха визуализирани с помощта на инструмента ESPript (версия 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Освен това, предсказаните функционални представителни домейни и консервативни сайтове на S. sclerotiorum SsOAH бяха интерактивно класифицирани в различни семейства, използвайки инструмента InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Накрая, триизмерно (3D) структурно моделиране на предсказания S. sclerotiorum SsOAH беше извършено с помощта на Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 сървър версия 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) и валидирано с помощта на SWISS-MODEL сървъра (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Предсказаните триизмерни структури (PDB формат) бяха интерактивно визуализирани с помощта на пакета UCSF-Chimera (версия 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
За определяне на транскрипционното ниво на оксалоацетат ацетилхидролаза (SsOAH; GenBank accession number: XM_001590428.1) в мицела на Sclerotinia sclerotiorum беше използвана количествена флуоресцентна PCR в реално време. Накратко, S. sclerotiorum беше инокулиран в колба, съдържаща PDB, и поставен в разклащащ се инкубатор (модел: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) при 25 ± 2 °C за 24 часа при 150 rpm и в постоянна тъмнина (24 часа), за да се стимулира растежът на мицела. След това клетките бяха третирани с L-орнитин и фунгицида Rizolex-T при крайни IC50 концентрации (съответно приблизително 40 и 3,2 mg/L) и след това култивирани за още 24 часа при същите условия. След инкубацията, културите бяха центрофугирани при 2500 rpm за 5 минути и супернатантата (гъбичен мицел) беше събрана за анализ на генната експресия. По подобен начин, гъбичен мицел беше събран на 0, 24, 48, 72, 96 и 120 часа след инфекцията от заразени растения, които бяха образували бяла плесен и памучен мицел върху повърхността на заразените тъкани. РНК беше екстрахирана от гъбичния мицел и след това кДНК беше синтезирана, както е описано по-горе. Праймерните последователности за SsOAH са изброени в Допълнителна таблица S3. SsActin (номер за достъп в GenBank: XM_001589919.1) беше използван като основен ген, а относителната генна експресия беше изчислена с помощта на метода 2-ΔΔCT (Livak and Schmittgen, 2001).
Оксалова киселина беше определена в картофено-декстрозен бульон (PDB) и растителни проби, съдържащи гъбния патоген Sclerotinia sclerotiorum, съгласно метода на Xu и Zhang (2000) с леки модификации. Накратко, изолатите на S. sclerotiorum бяха инокулирани в колби, съдържащи PDB, и след това култивирани в разклащащ се инкубатор (модел I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) при 150 rpm при 25 ± 2 °C в продължение на 3–5 дни при постоянна тъмнина (24 часа), за да се стимулира растежът на мицела. След инкубацията, гъбната култура първо беше филтрирана през филтърна хартия Whatman #1 и след това центрофугирана при 2500 rpm за 5 минути, за да се отстрани остатъчният мицел. Супернатантът беше събран и съхраняван при 4°C за по-нататъшно количествено определяне на оксалат. За приготвянето на растителни проби, приблизително 0,1 g фрагменти от растителна тъкан бяха екстрахирани три пъти с дестилирана вода (по 2 ml всеки път). След това пробите бяха центрофугирани при 2500 rpm за 5 минути, супернатантата беше филтрирана на сухо през филтърна хартия Whatman No. 1 и събрана за по-нататъшен анализ.
За количествен анализ на оксалова киселина, реакционната смес се приготвя в стъклена епруветка със запушалка в следния ред: 0,2 ml проба (или филтрат от PDB култура или стандартен разтвор на оксалова киселина), 0,11 ml бромофенол синьо (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml 1 M сярна киселина (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) и 0,176 ml 100 mM калиев дихромат (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), след което разтворът се разрежда до 4,8 ml с дестилирана вода, разбърква се енергично и веднага се поставя във водна баня с температура 60°C. След 10 минути реакцията се спира чрез добавяне на 0,5 ml разтвор на натриев хидроксид (NaOH; 0,75 M). Абсорбцията (A600) на реакционната смес беше измерена при 600 nm с помощта на UV-160 спектрофотометър (Shimadzu Corporation, Япония). PDB и дестилирана вода бяха използвани като контроли за количествено определяне на културалните филтрати и съответно на растителните проби. Концентрациите на оксалова киселина в културалните филтрати, изразени като микрограми оксалова киселина на милилитър PDB среда (μg.mL−1), и в листните екстракти, изразени като микрограми оксалова киселина на грам прясно тегло (μg.g−1 FW), бяха определени с помощта на калибрационна крива на оксалова киселина (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, САЩ).
По време на проучването всички експерименти са проектирани по напълно рандомизиран дизайн (CRD) с шест биологични повторения на третиране и пет саксии на биологично повторение (две растения на саксия), освен ако не е посочено друго. Биологичните повторения са анализирани в два екземпляра (две технически повторения). Техническите повторения са използвани за проверка на възпроизводимостта на един и същ експеримент, но не са използвани в статистическия анализ, за ​​да се избегнат фалшиви повторения. Данните са анализирани статистически с помощта на дисперсионен анализ (ANOVA), последван от тест на Tukey-Kramer за честно значима разлика (HSD) (p ≤ 0,05). За in vitro експерименти, стойностите на IC50 и IC99 са изчислени с помощта на probit модела и са изчислени 95% доверителни интервали.
Общо четири изолата бяха събрани от различни соеви полета в провинция Ел Габия, Египет. Върху PDA среда всички изолата произведоха кремаво бял мицел, който бързо стана памучно бял (Фигура 1А), а след това бежов или кафяв на етап склероций. Склероциите обикновено са плътни, черни, сферични или неправилни по форма, с дължина от 5,2 до 7,7 mm и диаметър от 3,4 до 5,3 mm (Фигура 1B). Въпреки че четири изолата развиха маргинален модел от склероции по ръба на хранителната среда след 10–12 дни инкубация при 25 ± 2 °C (Фиг. 1А), броят на склероциите на плака се различаваше значително между тях (P < 0,001), като изолат 3 имаше най-голям брой склероции (32,33 ± 1,53 склероции на плака; Фиг. 1C). По подобен начин, изолат #3 произвежда повече оксалова киселина в PDB, отколкото други изолати (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Фиг. 1D). Изолат #3 показва типични морфологични и микроскопски характеристики на фитопатогенната гъба Sclerotinia sclerotiorum. Например, върху PDA колониите от изолат #3 растат бързо, са кремаво бели (Фигура 1A), обратно бежови или светло жълто-кафяви с цвят на сьомга и се нуждаят от 6-7 дни при 25 ± 2°C, за да покрият напълно повърхността на плака с диаметър 9 cm. Въз основа на горните морфологични и микроскопски характеристики, изолат #3 е идентифициран като Sclerotinia sclerotiorum.
Фигура 1. Характеристики и патогенност на изолати на S. sclerotiorum от обикновени бобови култури. (A) Мицелен растеж на четири изолата на S. sclerotiorum върху PDA среда, (B) склероции на четири изолата на S. sclerotiorum, (C) брой склероции (на плака), (D) секреция на оксалова киселина върху PDB среда (μg.mL−1) и (E) тежест на заболяването (%) на четири изолата на S. sclerotiorum върху чувствителен търговски сорт бобови култури Giza 3 при оранжерийни условия. Стойностите представляват средната стойност ± SD на пет биологични повторения (n = 5). Различните букви показват статистически значими разлики между третиранията (p < 0,05). (F–H) Типични симптоми на бяла плесен се появяват съответно върху надземните стъбла и силиките, 10 дни след инокулацията с изолат #3 (dpi). (I) Еволюционният анализ на вътрешния транскрибиран спейсър (ITS) регион на изолат #3 на S. sclerotiorum е извършен с помощта на метода на максималната вероятност и е сравнен с 20 референтни изолата/щама, получени от базата данни на Националния център за биотехнологична информация (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Числата над линиите на клъстериране показват покритието на региона (%), а числата под линиите на клъстериране показват дължината на разклонението.
Освен това, за да се потвърди патогенността, четири получени изолата на S. sclerotiorum бяха използвани за инокулиране на чувствителния търговски сорт боб Giza 3 в оранжерийни условия, което е в съответствие с постулатите на Кох (фиг. 1E). Въпреки че всички получени гъбични изолати бяха патогенни и можеха да заразят зеления фасул (сорт Giza 3), причинявайки типични симптоми на бяла плесен по всички надземни части (фиг. 1F), особено по стъблата (фиг. 1G) и шушулките (фиг. 1H) 10 дни след инокулацията (dpi), изолат 3 беше най-агресивният изолат в два независими експеримента. Изолат 3 имаше най-висока тежест на заболяването (%) по бобовите растения (съответно 24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 и 76,7 ± 3,1 на 7, 14 и 21 дни след инфекцията; Фигура 1F).
Идентифицирането на най-инвазивния изолат #3 на S. sclerotiorum беше допълнително потвърдено въз основа на вътрешно транскрибирано спейсърно (ITS) секвениране (фиг. 1I). Филогенетичният анализ между изолат #3 и 20 референтни изолата/щама показа високо сходство (>99%) между тях. Заслужава да се отбележи, че изолат #3 на S. sclerotiorum (533 bp) има високо сходство с американския изолат LPM36 на S. sclerotiorum, изолиран от сухи грахови семена (GenBank accession nomer MK896659.1; 540 bp), и китайския изолат YKY211 на S. sclerotiorum (GenBank accession nomer OR206374.1; 548 bp), който причинява виолетово (Matthiola incana) гниене на стъблото, като всички те са групирани отделно в горната част на дендрограмата (Фигура 1I). Новата последователност е депозирана в базата данни на NCBI и е наречена „Sclerotinia sclerotiorum – изолат YN-25“ (номер за достъп в GenBank PV202792). Вижда се, че изолат 3 е най-инвазивният изолат; следователно, този изолат е избран за изследване във всички последващи експерименти.
Антибактериалната активност на диамин L-орнитин (Sigma-Aldrich, Дармщат, Германия) при различни концентрации (12,5, 25, 50, 75, 100 и 125 mg/L) срещу изолат 3 на S. sclerotiorum е изследвана in vitro. Прави впечатление, че L-орнитинът проявява антибактериален ефект и постепенно инхибира радиалния растеж на хифите на S. sclerotiorum по дозозависим начин (Фигура 2A, B). При най-високата тествана концентрация (125 mg/L), L-орнитинът демонстрира най-висока степен на инхибиране на растежа на мицела (99,62 ± 0,27%; Фигура 2B), което е еквивалентно на търговския фунгицид Rizolex-T (степен на инхибиране 99,45 ± 0,39%; Фигура 2C) при най-високата тествана концентрация (10 mg/L), което показва подобна ефикасност.
Фигура 2. In vitro антибактериална активност на L-орнитин срещу Sclerotinia sclerotiorum. (A) Сравнение на антибактериалната активност на различни концентрации на L-орнитин срещу S. sclerotiorum с търговския фунгицид Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Степен на инхибиране (%) на мицелния растеж на S. sclerotiorum след третиране с различни концентрации на L-орнитин (12,5, 25, 50, 75, 100 и 125 mg/L) или Rizolex-T (2, 4, 6, 8 и 10 mg/L), съответно. Стойностите представляват средната стойност ± SD на пет биологични повторения (n = 5). Различните букви означават статистически разлики между третиранията (p < 0,05). (D, E) Регресионен анализ на Probit модел на L-орнитин и търговски фунгицид Rizolex-T, съответно. Регресионната линия на пробит модела е показана като плътна синя линия, а доверителният интервал (95%) е показан като пунктирана червена линия.
Освен това беше извършен пробит регресионен анализ и съответните графики са показани в Таблица 1 и Фигури 2D,E. Накратко, приемливата стойност на наклона (y = 2.92x − 4.67) и свързаната с нея значима статистика (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 и p < 0.0001; Фигура 2D) на L-орнитин показват повишена противогъбична активност срещу S. sclerotiorum в сравнение с търговския фунгицид Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 и p < 0.0001) (Таблица 1).
Таблица 1. Стойности на полумаксималната инхибираща концентрация (IC50) и IC99 (mg/l) на L-орнитин и търговски фунгицид „Rizolex-T“ срещу S. sclerotiorum.
Като цяло, L-орнитинът (250 mg/L) значително намалява развитието и тежестта на бялата плесен върху третираните растения от обикновен фасул в сравнение с нетретираните растения, заразени с S. sclerotiorum (контрола; Фигура 3А). Накратко, въпреки че тежестта на заболяването при нетретираните заразени контролни растения постепенно се увеличава (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 и 92,33 ± 3,06%), L-орнитинът значително намалява тежестта на заболяването (%) по време на целия експеримент (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 и 26,36 ± 3,07) съответно на 7, 14 и 21 дни след третирането (dpt) (Фигура 3А). По подобен начин, когато заразените с S. sclerotiorum растения от боб са третирани с 250 mg/L L-орнитин, площта под кривата на прогресия на заболяването (AUDPC) намалява от 1274,33 ± 33,13 в нетретираната контрола до 281,03 ± 7,95, което е малко по-ниско от това на положителната контрола 50 mg/L фунгицид Rizolex-T (183,61 ± 7,71; Фиг. 3B). Същата тенденция се наблюдава и във втория експеримент.
Фиг. 3. Ефект от екзогенното приложение на L-орнитин върху развитието на бяло гниене по обикновения фасул, причинено от Sclerotinia sclerotiorum при оранжерийни условия. (A) Крива на прогресията на заболяването при бялото гниене по обикновения фасул след третиране с 250 mg/L L-орнитин. (B) Площ под кривата на прогресията на заболяването (AUDPC) при бялото гниене по обикновения фасул след третиране с L-орнитин. Стойностите представляват средната стойност ± SD на пет биологични повторения (n = 5). Различните букви означават статистически значими разлики между третиранията (p < 0,05).
Екзогенното приложение на 250 mg/L L-орнитин постепенно увеличава височината на растенията (фиг. 4A), броя на клоните на растение (фиг. 4B) и броя на листата на растение (фиг. 4C) след 42 дни. Докато търговският фунгицид Rizolex-T (50 mg/L) има най-голям ефект върху всички изследвани хранителни параметри, екзогенното приложение на 250 mg/L L-орнитин има втория по големина ефект в сравнение с нетретираните контроли (фиг. 4A–C). От друга страна, третирането с L-орнитин не е оказало значителен ефект върху съдържанието на фотосинтетични пигменти хлорофил a (фиг. 4D) и хлорофил b (фиг. 4E), но леко увеличава общото съдържание на каротеноиди (0,56 ± 0,03 mg/g frost wt) в сравнение с отрицателната контрола (0,44 ± 0,02 mg/g frost wt) и положителната контрола (0,46 ± 0,02 mg/g frost wt; фиг. 4F). Като цяло, тези резултати показват, че L-орнитинът не е фитотоксичен за третираните бобови растения и дори може да стимулира растежа им.
Фиг. 4. Ефект от екзогенното приложение на L-орнитин върху растежните характеристики и фотосинтетичните пигменти на листа от боб, заразени със Sclerotinia sclerotiorum при оранжерийни условия. (A) Височина на растението (см), (B) Брой клони на растение, (C) Брой листа на растение, (D) Съдържание на хлорофил a (mg g-1 сухо тегло), (E) Съдържание на хлорофил b (mg g-1 сухо тегло), (F) Общо съдържание на каротеноиди (mg g-1 сухо тегло). Стойностите са средната стойност ± SD на пет биологични повторения (n = 5). Различните букви показват статистически значими разлики между третиранията (p < 0,05).
Хистохимичната локализация in situ на реактивни кислородни видове (ROS; изразени като водороден пероксид [H2O2]) и свободни радикали (изразени като супероксидни аниони [O2•−]) разкри, че екзогенното приложение на L-орнитин (250 mg/L) значително намалява натрупването на H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Фиг. 5A) и O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Фиг. 5B) в сравнение с натрупването както на нетретирани заразени растения (съответно 173.31 ± 12.06 и 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW), така и на растения, третирани с 50 mg/L от търговския фунгицид Rizolex-T (съответно 170.12 ± 9.50 и 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt) след 72 часа. Високи нива на H2O2 и O2•− се натрупват при hpt (фиг. 5A, B). По подобен начин, анализ с малононов диалдехид (MDA) на базата на TCA показа, че заразените с S. sclerotiorum растения боб натрупват по-високи нива на MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) в листата си (фиг. 5C). Въпреки това, екзогенното приложение на L-орнитин значително намалява липидната пероксидация, както се вижда от намаляването на съдържанието на MDA в третираните растения (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Фиг. 5. Ефект от екзогенното приложение на L-орнитин върху основните маркери на оксидативен стрес и неензимни антиоксидантни защитни механизми в листа от боб, заразени с S. sclerotiorum, 72 часа след инфекцията при оранжерийни условия. (A) Водороден пероксид (H2O2; nmol g−1 FW) при 72 hpt, (B) супероксиден анион (O2•−; nmol g−1 FW) при 72 hpt, (C) малонодиалдехид (MDA; nmol g−1 FW) при 72 hpt, (D) общо разтворими феноли (mg GAE g−1 FW) при 72 hpt, (E) общо разтворими флавоноиди (mg RE g−1 FW) при 72 hpt, (F) общо свободни аминокиселини (mg g−1 FW) при 72 hpt и (G) съдържание на пролин (mg g−1 FW) при 72 hpt. Стойностите представляват средната стойност ± стандартно отклонение (средна стойност ± SD) на 5 биологични повторения (n = 5). Различните букви показват статистически значими разлики между леченията (p < 0,05).