Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка за CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да изключите режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим непрекъсната поддръжка, ще показваме сайта без стилове и JavaScript.
Инсулиновите наночастици (НЧ) с високо съдържание на зареждане са намерили различни приложения в различни лекарствени форми. Тази работа има за цел да оцени ефекта от процесите на лиофилизиране и спрей сушене върху структурата на заредени с инсулин хитозанови наночастици, със или без манитол като криопротектор. Също така оценихме качеството на тези наночастици чрез повторното им разтваряне. Преди дехидратация размерът на частиците на омрежените наночастици хитозан/натриев триполифосфат/инсулин беше оптимизиран да бъде 318 nm, PDI беше 0,18, ефективността на капсулиране беше 99,4%, а зареждането беше 25,01%. След разтваряне всички наночастици, с изключение на тези, получени чрез метод на лиофилизиране без използване на манитол, запазиха своята сферична структура на частиците. В сравнение с наночастиците, съдържащи манитол, дехидратирани чрез спрей, спрей сушените наночастици без манитол също показаха най-малък среден размер на частиците (376 nm) и най-високо съдържание на зареждане (25,02%) с подобна скорост на капсулиране (98,7%) и PDI. (0,20) чрез техники на сушене или лиофилизация. Изсушените наночастици чрез спрей сушене без манитол също водят до най-бързо освобождаване на инсулин и най-висока ефективност на клетъчното усвояване. Тази работа показва, че спрей сушенето може да дехидратира инсулиновите наночастици без необходимост от криопротектанти в сравнение с конвенционалните методи за лиофилизация, създавайки по-голям капацитет на натоварване, по-ниски изисквания за добавки и значително предимство при оперативни разходи.
От откриването си през 1922 г.1,2,3, инсулинът и неговите фармацевтични препарати са спасили живота на пациенти с диабет тип 1 (T1DM) и диабет тип 2 (T1DM). Въпреки това, поради свойствата си на протеин с високо молекулно тегло, инсулинът лесно се агрегира, разгражда от протеолитични ензими и се елиминира чрез ефекта на първо преминаване. Хората, диагностицирани с диабет тип 1, се нуждаят от инсулинови инжекции до края на живота си. Много пациенти, първоначално диагностицирани с диабет тип 2, също се нуждаят от дългосрочни инсулинови инжекции. Ежедневните инсулинови инжекции са сериозен източник на ежедневна болка и дискомфорт за тези хора, с отрицателни последици за психичното здраве. В резултат на това други форми на приложение на инсулин, които причиняват по-малко дискомфорт, като например перорално приложение на инсулин, се изучават обстойно5, тъй като имат потенциала да възстановят качеството на живот на приблизително 5 милиарда души с диабет по целия свят.
Технологията с наночастици осигури значителен напредък в опитите за перорален прием на инсулин4,6,7. Такъв, който ефективно капсулира и предпазва инсулина от разграждане за целенасочено доставяне до специфични места на тялото. Използването на наночастици обаче има няколко ограничения, главно поради проблеми със стабилността на суспензиите от частици. По време на съхранение може да възникне известна агрегация, което намалява бионаличността на наночастиците, заредени с инсулин8. Освен това, химическата стабилност на полимерната матрица от наночастици и инсулина също трябва да се вземе предвид, за да се гарантира стабилността на инсулиновите наночастици (НЧ). Понастоящем технологията за лиофилизиране е златният стандарт за създаване на стабилни НЧ, като същевременно се предотвратяват нежелани промени по време на съхранение9.
Въпреки това, лиофилизацията изисква добавяне на криопротектанти, за да се предотврати повлияването на сферичната структура на наночастиците от механичното напрежение на ледените кристали. Това значително намалява натоварването на инсулиновите наночастици след лиофилизация, тъй като криопротектантът заема по-голямата част от тегловното съотношение. Следователно, получените инсулинови наночастици често се оказват неподходящи за производството на сухи прахообразни формулировки, като перорални таблетки и перорални филми, поради необходимостта от големи количества сухи наночастици за постигане на терапевтичния прозорец на инсулина.
Сушенето чрез разпръскване е добре познат и евтин процес в индустриален мащаб за производство на сухи прахове от течни фази във фармацевтичната индустрия10,11. Контролът върху процеса на образуване на частици позволява правилно капсулиране на няколко биоактивни съединения12, 13. Освен това, то се е превърнало в ефективна техника за приготвяне на капсулирани протеини за перорално приложение. По време на сушенето чрез разпръскване водата се изпарява много бързо, което помага да се поддържа ниска температура на ядрото на частиците11,14, което позволява прилагането му за капсулиране на чувствителни към топлина компоненти. Преди сушенето чрез разпръскване, покривният материал трябва да бъде старателно хомогенизиран с разтвора, съдържащ капсулираните съставки11,14. За разлика от лиофилизацията, хомогенизирането преди капсулиране при сушенето чрез разпръскване подобрява ефективността на капсулирането по време на дехидратация. Тъй като процесът на капсулиране чрез сушене чрез разпръскване не изисква криопротектанти, сушенето чрез разпръскване може да се използва за производство на сухи наночастици с високо съдържание на зареждане.
Това проучване представя производството на наночастици, заредени с инсулин, чрез омрежване на хитозан и натриев триполифосфат, използвайки йонен гел метод. Йонното желатиране е метод за получаване, който позволява производството на наночастици чрез електростатични взаимодействия между два или повече йонни вида при определени условия. За дехидратиране на оптимизираните наночастици, омрежени с хитозан/натриев триполифосфат/инсулин, са използвани както техники за лиофилизация, така и техники за спрей сушене. След дехидратация, тяхната морфология е анализирана чрез SEM. Тяхната способност за рекомбинация е оценена чрез измерване на тяхното разпределение на размера, повърхностен заряд, PDI, ефективност на капсулиране и съдържание на зареждане. Качеството на повторно разтворените наночастици, получени чрез различни методи на дехидратация, също е оценено чрез сравняване на тяхната инсулинова защита, поведение на освобождаване и ефикасност на клетъчно усвояване.
PH на смесения разтвор и съотношението на хитозан и инсулин са два ключови фактора, които влияят върху размера на частиците и ефективността на капсулиране (EE) на крайните наночастици, тъй като те пряко влияят върху йонотропния процес на желиране. pH на смесения разтвор е силно корелирано с размера на частиците и ефективността на капсулиране (фиг. 1а). Както е показано на фиг. 1а, с повишаване на pH от 4,0 до 6,0, средният размер на частиците (nm) намалява и EE се увеличава значително, докато когато pH се повишава до 6,5, средният размер на частиците започва да се увеличава, а EE остава непроменена. С увеличаване на съотношението на хитозана към инсулина, средният размер на частиците също се увеличава. Освен това, не се наблюдава промяна в EE, когато наночастиците са приготвени при масово съотношение хитозан/инсулин по-високо от 2,5:1 (w/w) (фиг. 1б). Следователно, оптималните условия за приготвяне в това проучване (pH 6,0, масово съотношение хитозан/инсулин 2,5:1) са използвани за приготвяне. наночастици, заредени с инсулин, за по-нататъшно изследване. При тези условия на приготвяне, средният размер на частиците на инсулиновите наночастици е оптимизиран да бъде 318 nm (фиг. 1в), PDI е 0,18, ефективността на вграждане е 99,4%, зета потенциалът е 9,8 mv, а инсулиновото натоварване е 25,01% (m/m). Въз основа на резултатите от трансмисионната електронна микроскопия (TEM), оптимизираните наночастици са приблизително сферични и дискретни с относително еднакъв размер (фиг. 1d).
Оптимизация на параметрите на инсулинови наночастици: (а) влиянието на pH върху средния диаметър и ефективността на капсулиране (EE) на инсулинови наночастици (приготвени при масово съотношение 5:1 на хитозан и инсулин); (б) хитозан и влияние на масовото съотношение на инсулина върху средния диаметър и ефективността на капсулиране (EE) на инсулинови наночастици (приготвени при pH 6); (в) разпределение на размера на частиците на оптимизирани инсулинови наночастици; (г) TEM микрофотография на оптимизирани инсулинови наночастици.
Добре известно е, че хитозанът е слаб полиелектролит с pKa от 6,5. Той е положително зареден в киселинна среда, тъй като основната му аминогрупа е протонирана от водородни йони15. Следователно, той често се използва като носител за капсулиране на отрицателно заредени макромолекули. В това проучване хитозанът е използван за капсулиране на инсулин с изоелектрична точка от 5,3. Тъй като хитозанът се използва като покривен материал, с увеличаване на неговия дял, дебелината на външния слой на наночастиците се увеличава съответно, което води до по-голям среден размер на частиците. Освен това, по-високите нива на хитозан могат да капсулират повече инсулин. В нашия случай, EE беше най-висока, когато съотношението на хитозан и инсулин достигна 2,5:1, и не се наблюдаваше значителна промяна в EE, когато съотношението продължи да се увеличава.
Освен съотношението на хитозана и инсулина, pH също играе решаваща роля при получаването на наночастици. Gan et al.17 изследват ефекта на pH върху размера на частиците на хитозановите наночастици. Те установяват непрекъснато намаляване на размера на частиците, докато pH достигне 6,0, и значително увеличение на размера на частиците се наблюдава при pH > 6,0, което е в съответствие с нашите наблюдения. Това явление се дължи на факта, че с повишаване на pH, молекулата на инсулина придобива отрицателен повърхностен заряд, като по този начин благоприятства електростатичните взаимодействия с комплекса хитозан/натриев триполифосфат (TPP), което води до малък размер на частиците и висока EE (ефективност на аминогрупата). Когато обаче pH се регулира до 6,5, аминогрупите на хитозана се депротонират, което води до сгъване на хитозана. По този начин, високото pH води до по-малко излагане на амино йони на TPP и инсулин, което води до по-ниско омрежване, по-голям краен среден размер на частиците и по-ниска EE.
Анализът на морфологичните свойства на лиофилизираните и спрей-сушените наночастици може да насочи избора на по-добри техники за дехидратация и образуване на прах. Предпочитаният метод трябва да осигурява стабилност на лекарството, равномерна форма на частиците, високо лекарствено натоварване и добра разтворимост в оригиналния разтвор. В това проучване, за да се сравнят по-добре двете техники, по време на дехидратация са използвани инсулинови наночастици със или без 1% манитол. Манитолът се използва като обемообразуващ агент или криопротектор в различни сухи прахообразни формулировки за лиофилизиране и спрей-сушене. За лиофилизираните инсулинови наночастици без манитол, както е показано на Фигура 2а, под сканираща електронна микроскопия (SEM) е наблюдавана силно пореста прахообразна структура с големи, неправилни и грапави повърхности. В праха след дехидратация са открити малко дискретни частици (Фиг. 2д). Тези резултати показват, че повечето наночастици са разложени по време на лиофилизацията без криопротектор. За лиофилизираните и спрей-сушени инсулинови наночастици, съдържащи 1% манитол, са наблюдавани сферични наночастици с гладки повърхности (Фиг. 2b,d,f,h). Инсулиновите наночастици, спрей-сушени без манитол, остават сферични, но... набръчкана повърхност (фиг. 2в). Сферичните и набръчкани повърхности са разгледани по-подробно в тестовете за поведение на освобождаване и клетъчно поглъщане по-долу. Въз основа на видимия вид на изсушените наночастици, както спрей-сушените наночастици без манитол, така и лиофилизираните и спрей-сушените наночастици с манитол, дават фини прахообразни наночастици (фиг. 2f,g,h). Колкото по-голяма е повърхността между повърхностите на частиците, толкова по-висока е разтворимостта и следователно толкова по-висока е скоростта на освобождаване.
Морфология на различни дехидратирани инсулинови наночастици: (a) SEM изображение на лиофилизирани инсулинови наночастици без манитол; (b) SEM изображение на лиофилизирани инсулинови наночастици с манитол; (c) спрей-сушени инсулинови наночастици без манитол SEM изображение на; (d) SEM изображение на спрей-сушени инсулинови наночастици с манитол; (e) изображение на лиофилизиран прах от инсулинови наночастици без манитол; (f) изображение на лиофилизирани инсулинови наночастици с манитол; (g) изображение на спрей-сушени инсулинови наночастици на прах без манитол; (h) изображение на спрей-сушени инсулинови наночастици на прах с манитол.
По време на лиофилизацията, манитолът действа като криопротектор, поддържайки наночастиците в аморфна форма и предотвратявайки увреждането от ледени кристали19. За разлика от това, по време на спрей сушенето няма стъпка на замразяване. Следователно, манитол не е необходим при този метод. Всъщност, спрей сушените наночастици без манитол дават по-фини наночастици, както е описано по-рано. Въпреки това, манитолът все още може да действа като пълнител в процеса на спрей сушене, за да придаде на наночастиците по-сферична структура20 (фиг. 2d), което помага за постигане на равномерно поведение на освобождаване на такива капсулирани наночастици. Освен това е ясно, че някои големи частици могат да бъдат открити както в лиофилизирани, така и в спрей сушени инсулинови наночастици, съдържащи манитол (фиг. 2b,d), което може да се дължи на натрупването на манитол в ядрото на частицата заедно с капсулирания инсулин. Слой от хитозана. Струва си да се отбележи, че в това проучване, за да се гарантира, че сферичната структура остава непокътната след дехидратация, съотношението манитол и хитозан се поддържа на 5:1, така че голямо количество пълнител може също да увеличи размера на частиците на изсушените наночастици.
Спектроскопия с Фурие трансформация на инфрачервено отслабено пълно отражение (FTIR-ATR) характеризира физическата смес от свободен инсулин, хитозан, хитозан, TPP и инсулин. Всички дехидратирани наночастици бяха характеризирани с помощта на FTIR-ATR спектроскопия. Забележително е, че интензитетът на лентите от 1641, 1543 и 1412 cm-1 е наблюдаван в капсулирани наночастици, лиофилизирани с манитол, и в наночастици, спрей сушени със и без манитол (фиг. 3). Както беше съобщено по-рано, тези увеличения на силата са свързани с омрежване между хитозана, TPP и инсулина. Изследването на взаимодействието между хитозана и инсулина показа, че в FTIR спектрите на наночастици, заредени с инсулин, хитозановата лента се припокрива с тази на инсулина, увеличавайки интензитета на карбонилната (1641 cm-1) и аминовата (1543 cm-1) лента. Триполифосфатните групи на TPP са свързани с амониеви групи в хитозана, образувайки лента при 1412 cm-1.
FTIR-ATR спектри на свободен инсулин, хитозан, физични смеси от хитозан/TPP/инсулин и наночастици, дехидратирани по различни методи.
Освен това, тези резултати са в съответствие с показаните в SEM, които показват, че капсулираните наночастици остават непокътнати както при пръскане, така и при лиофилизиране с манитол, но при липса на манитол, само спрей сушенето произвежда капсулирани частици. За разлика от това, FTIR-ATR спектралните резултати на наночастици, лиофилизирани без манитол, са много подобни на физическата смес от хитозан, TPP и инсулин. Този резултат показва, че кръстосаните връзки между хитозана, TPP и инсулина вече не присъстват в наночастиците, лиофилизирани без манитол. Структурата на наночастиците е разрушена по време на лиофилизирането без криопротектор, което може да се види в SEM резултатите (фиг. 2а). Въз основа на морфологията и FTIR резултатите на дехидратирани инсулинови наночастици, само лиофилизирани, спрей сушени и без манитол наночастици са използвани за експерименти за реконституиране, а без манитол - наночастици поради разграждането на наночастици без манитол по време на дехидратация. обсъдете.
Дехидратацията се използва за дългосрочно съхранение и преработка в други формулировки. Способността на сухите наночастици (NPs) да се възстановяват след съхранение е от решаващо значение за тяхното използване в различни формулировки, като таблетки и филми. Забелязахме, че средният размер на частиците на спрей-сушените инсулинови наночастици при липса на манитол се е увеличил само леко след възстановяване. От друга страна, размерът на частиците на спрей-сушените и лиофилизираните инсулинови наночастици с манитол се е увеличил значително (Таблица 1). PDI и EE не са се променили значително (p > 0,05) след рекомбинация на всички наночастици в това проучване (Таблица 1). Този резултат показва, че повечето частици са останали непокътнати след повторното разтваряне. Добавянето на манитол обаче е довело до значително намалено инсулиново натоварване на лиофилизирани и спрей-сушени манитолови наночастици (Таблица 1). За разлика от това, съдържанието на инсулиново натоварване в спрей-сушените наночастици без манитол е останало същото както преди (Таблица 1).
Добре известно е, че натоварването с наночастици е от решаващо значение, когато се използва за доставяне на лекарства. За наночастици с ниски натоварвания са необходими много големи количества материал, за да се достигне терапевтичният праг. Високият вискозитет на такива високи концентрации на наночастици обаче води до неудобства и трудности при перорално приложение и инжекционни формулировки, съответно 22. Освен това, инсулиновите наночастици могат да се използват и за направата на таблетки и вискозни биофилми 23, 24, което изисква използването на големи количества наночастици при ниски нива на натоварване, което води до големи таблетки и дебели биофилми, които не са подходящи за перорално приложение. Следователно, дехидратираните наночастици с високо инсулиново натоварване са силно желани. Нашите резултати показват, че високото инсулиново натоварване на наночастици, изсушени чрез пулверизиране без манитол, може да предложи много атрактивни предимства за тези алтернативни методи за доставяне.
Всички дехидратирани наночастици са съхранявани в хладилник в продължение на три месеца. Резултатите от SEM показват, че морфологията на всички дехидратирани наночастици не се е променила значително по време на тримесечното съхранение (фиг. 4). След разтваряне във вода, всички наночастици показват леко намаление на EE и освобождават приблизително малко количество (~5%) инсулин по време на тримесечния период на съхранение (Таблица 2). Средният размер на частиците на всички наночастици обаче се увеличава. Размерът на частиците на наночастиците, сушени чрез пулверизиране без манитол, се увеличава до 525 nm, докато този на сушените чрез пулверизиране и лиофилизираните наночастици с манитол се увеличава съответно до 872 и 921 nm (Таблица 2).
Морфология на различни дехидратирани инсулинови наночастици, съхранявани в продължение на три месеца: (а) SEM изображение на лиофилизирани инсулинови наночастици с манитол; (б) SEM изображение на спрей-сушени инсулинови наночастици без манитол; (в) без манитол SEM изображения на спрей-сушени инсулинови наночастици.
Освен това, в реконституираните инсулинови наночастици, изсушени чрез пулверизиране с манитол и лиофилизирани (фиг. S2), са наблюдавани утайки. Това може да се дължи на факта, че големите частици не се суспендират правилно във водата. Всички горепосочени резултати показват, че техниката на пулверизационно сушене може да предпази инсулиновите наночастици от дехидратация и че могат да се получат високи количества инсулинови наночастици без никакви пълнители или криопротектанти.
Задържането на инсулин е тествано в среда с pH = 2,5 с пепсин, трипсин и α-химотрипсин, за да се демонстрира защитната способност на наночастиците (NPs) срещу ензимно разграждане след дехидратация. Задържането на инсулин на дехидратирани наночастици е сравнено с това на прясно приготвени наночастици, а свободният инсулин е използван като отрицателна контрола. В това проучване свободният инсулин показва бързо елиминиране на инсулина в рамките на 4 часа и при трите ензимни обработки (Фиг. 5a-c). За разлика от това, тестването за елиминиране на инсулин на наночастици, лиофилизирани с манитол, и наночастици, сушени чрез спрей със или без манитол, показва значително по-висока защита на тези наночастици срещу ензимно разграждане, която е подобна на тази на прясно приготвени инсулинови наночастици (Фигура 1).5a-c). С помощта на наночастици в пепсин, трипсин и α-химотрипсин, повече от 50%, 60% и 75% от инсулина могат да бъдат защитени съответно в рамките на 4 часа (Фиг. 5a-c). Тази инсулинозащитна способност може да увеличи шанса за по-висока абсорбция на инсулин в кръвния поток25. Тези резултати показват, че спреят... Сушенето с или без манитол и лиофилизирането с манитол може да запази инсулинозащитната способност на наночастиците след дехидратация.
Защитно поведение и поведение при освобождаване на дехидратирани инсулинови наночастици: (а) защита на инсулина в разтвор на пепсин; (б) защита на инсулина в разтвор на трипсин; (в) защита на инсулина от разтвор на α-химотрипсин; (г) Поведение при освобождаване на дехидратирани наночастици в разтвор с pH = 2,5; (д) Поведение при освобождаване на дехидратирани наночастици в разтвор с pH = 6,6; (е) Поведение при освобождаване на дехидратирани наночастици в разтвор с pH = 7,0.
Прясно приготвени и реконституирани сухи инсулинови наночастици бяха инкубирани в различни буфери (pH = 2.5, 6.6, 7.0) при 37°C, симулирайки pH средата на стомаха, дванадесетопръстника и горната част на тънките черва, за да се изследва ефектът на инсулина върху инсулиновата резистентност. Поведение на освобождаване в различни среди. Фрагмент от стомашно-чревния тракт. При pH = 2,5, натоварените с инсулин наночастици и ресолубилизираните сухи инсулинови наночастици показват първоначално бързо освобождаване в рамките на първия час, последвано от бавно освобождаване през следващите 5 часа (фиг. 5d). Това бързо освобождаване в началото най-вероятно е резултат от бърза повърхностна десорбция на протеинови молекули, които не са напълно имобилизирани във вътрешната структура на частицата. При pH = 6,5, натоварените с инсулин наночастици и реконституираните сухи инсулинови наночастици показват плавно и бавно освобождаване в продължение на 6 часа, тъй като pH на тестовия разтвор е подобно на това на приготвения с наночастици разтвор (фиг. 5e). При pH = 7, наночастиците са нестабилни и почти напълно се разлагат в рамките на първите два часа (фиг. 5f). Това е така, защото депротонирането на хитозана се случва при по-високо pH, което води до по-малко компактна полимерна мрежа и освобождаване на натоварен инсулин.
Освен това, инсулиновите наночастици, изсушени чрез пулверизиране без манитол, показаха по-бърз профил на освобождаване в сравнение с другите дехидратирани наночастици (фиг. 5d-f). Както беше описано по-рано, реконституираните инсулинови наночастици, изсушени без манитол, показаха най-малкия размер на частиците. Малките частици осигуряват по-голяма повърхност, така че по-голямата част от съответното лекарство ще бъде на или близо до повърхността на частиците, което ще доведе до бързо освобождаване на лекарството26.
Цитотоксичността на наночастиците е изследвана чрез MTT анализ. Както е показано на Фигура S4, е установено, че всички дехидратирани наночастици нямат значителен ефект върху клетъчната жизнеспособност при концентрации от 50–500 μg/ml, което предполага, че всички дехидратирани наночастици могат да се използват безопасно за достигане на терапевтичния прозорец.
Черният дроб е основният орган, чрез който инсулинът упражнява своите физиологични функции. HepG2 клетките са човешка хепатомна клетъчна линия, често използвана като in vitro модел за хепатоцитно усвояване. Тук HepG2 клетки бяха използвани за оценка на клетъчното усвояване на дехидратирани наночастици, използвайки методи на лиофилизиране и спрей сушене. Клетъчното усвояване чрез конфокално лазерно сканиране с помощта на флоуцитометрия и зрение след няколко часа инкубация със свободен FITC инсулин в концентрация от 25 μg/mL, прясно приготвени FITC инсулин-заредени наночастици и дехидратирани FITC инсулин-заредени наночастици при равни концентрации на инсулин. Извършени са наблюдения с количествена микроскопия (CLSM). Лиофилизирани наночастици без манитол бяха разрушени по време на дехидратацията и не бяха оценени в този тест. Интензитетът на вътреклетъчната флуоресценция на прясно приготвени инсулин-заредени наночастици, лиофилизирани наночастици с манитол и спрей-сушени наночастици със и без манитол (фиг. 6а) беше съответно 4,3, 2,6, 2,4 и 4,1 пъти по-висок от този на свободните. FITC-инсулинова група, съответно (Фиг. 6б). Тези резултати показват, че капсулираният инсулин е по-мощен при клетъчно усвояване от свободния инсулин, главно поради по-малкия размер на наночастиците, заредени с инсулин, получени в изследването.
Поемане на HepG2 клетки след 4 часа инкубация с прясно приготвени наночастици и дехидратирани наночастици: (а) Разпределение на поемането на FITC-инсулин от HepG2 клетки. (б) Средна геометрична стойност на интензитета на флуоресценция, анализирана чрез флуоцитометрия (n = 3), *P < 0,05 в сравнение със свободния инсулин.
По подобен начин, CLSM изображенията показват, че интензитетът на FITC флуоресценция на прясно приготвени FITC-инсулин-заредени наночастици и FITC-инсулин-заредени спрей-сушени наночастици (без манитол) е много по-силен от този на другите проби (фиг. 6а). Освен това, с добавянето на манитол, по-високият вискозитет на разтвора повишава устойчивостта на клетъчно усвояване, което води до намалена инсулинова пролиферация. Тези резултати показват, че спрей-сушените наночастици без манитол показват най-висока ефективност на клетъчно усвояване, тъй като размерът на частиците им е по-малък от този на лиофилизираните наночастици след повторно разтваряне.
Хитозан (средно молекулно тегло 100 KDa, 75–85% деацетилиран) е закупен от Sigma-Aldrich (Оуквил, Онтарио, Канада). Натриев триполифосфат (TPP) е закупен от VWR (Раднор, Пенсилвания, САЩ). Рекомбинантният човешки инсулин, използван в това проучване, е от Fisher Scientific (Уолтъм, Масачузетс, САЩ). Маркиран с флуоресцеин изотиоцианат (FITC) човешки инсулин и 4',6-диамидино-2-фенилиндол дихидрохлорид (DAPI) са закупени от Sigma-Aldrich (Оуквил, Онтарио, Канада). Клетъчната линия HepG2 е получена от ATCC (Манасас, Вирджиния, САЩ). Всички други реактиви са с аналитична или хроматографска чистота.
Пригответе 1 mg/ml CS разтвор, като го разтворите в двойно дестилирана вода (DD вода), съдържаща 0,1% оцетна киселина. Пригответе 1 mg/ml разтвори на TPP и инсулин, като ги разтворите съответно в DD вода и 0,1% оцетна киселина. Предварителната емулсия е приготвена с високоскоростен хомогенизатор Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Процесът на приготвяне е следният: първо, 2 ml TPP разтвор се добавят към 4 ml инсулинов разтвор и сместа се разбърква в продължение на 30 минути до пълно разбъркване. След това смесеният разтвор се добавя на капки към CS разтвора чрез спринцовка при високоскоростно разбъркване (10 000 rpm). Смесите се държат при високоскоростно разбъркване (15 000 rpm) в ледена баня в продължение на 30 минути и се регулират до определено pH, за да се получат омрежени инсулинови наночастици. За да се хомогенизират допълнително и да се намали размерът на частиците на инсулиновите наночастици, те се обработват с ултразвук за допълнителни 30 минути в... ледена баня с помощта на соникатор тип сонда (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Германия).
Инсулиновите НПС бяха тествани за Z-среден диаметър, индекс на полидисперсност (PDI) и зета потенциал, използвайки измервания на динамично разсейване на светлината (DLS) с помощта на Litesizer 500 (Anton Paar, Грац, Австрия) чрез разреждане в DD вода при 25°C. Морфологията и разпределението на размерите бяха характеризирани с трансмисионен електронен микроскоп (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Токио, Япония), а изображенията впоследствие бяха анализирани с помощта на софтуер за изображения Hitachi (Hitachi, Токио, Япония). За да се оцени ефективността на капсулиране (EE) и капацитетът на зареждане (LC) на инсулиновите НПС, НПС бяха пипетирани в ултрафилтрационни епруветки с гранично молекулно тегло от 100 kDa и центрофугирани при 500 xg за 30 минути. Некапсулираният инсулин във филтрата беше количествено определен с помощта на HPLC система Agilent 1100 Series (Agilent, Санта Клара, Калифорния, САЩ), състояща се от кватернерна помпа, автосамплер, нагревател на колоната и DAD детектор. Инсулинът беше анализиран. чрез колона C18 (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, САЩ) и детектирана при 214 nm. Мобилната фаза беше ацетонитрил и вода, съдържащи 0.1% TFA, градиентни съотношения от 10/90 до 100/0, и се провеждаше в продължение на 10 минути. Мобилната фаза беше изпомпвана със скорост на потока 1.0 ml/min. Температурата на колоната беше настроена на 20 °C. Изчислете процентите на EE и LC, като използвате уравнения (1) и уравнение (2).
Различни съотношения CS/инсулин, вариращи от 2,0 до 4,0, бяха тествани за оптимизиране на инсулиновите наночастици. Различни количества CS разтвор бяха добавени по време на приготвянето, докато сместа инсулин/TPP се поддържаше постоянна. Инсулиновите наночастици бяха приготвени в диапазона на pH от 4,0 до 6,5 чрез внимателен контрол на pH на сместа след добавяне на всички разтвори (инсулин, TPP и CS). Електрическата променлива (EE) и размерът на частиците на инсулиновите наночастици бяха оценени при различни стойности на pH и масови съотношения CS/инсулин, за да се оптимизира образуването на инсулинови наночастици.
Оптимизираните инсулинови наночастици бяха поставени върху алуминиев контейнер и покрити с тъкан, затегната с тиксо. Впоследствие завинтените контейнери бяха поставени в сушилня за замразяване Labconco FreeZone (Labconco, Канзас Сити, Мисури, САЩ), оборудвана с тарелкова сушилня. Температурата и вакуумното налягане бяха настроени на -10 °C, 0,350 Torr за първите 2 часа и 0 °C и 0,120 Torr за останалите 22 часа от 24-те часа, за да се получат сухи инсулинови наночастици.
За генериране на капсулиран инсулин е използвана мини спрей сушилня Buchi B-290 (BÜCHI, Флавил, Швейцария). Избраните параметри на сушене са: температура 100 °C, дебит на захранване 3 л/мин и дебит на газ 4 л/мин.
Инсулиновите наночастици преди и след дехидратация бяха характеризирани с помощта на FTIR-ATR спектроскопия. Дехидратираните наночастици, както и свободният инсулин и хитозан, бяха анализирани с помощта на Spectrum 100 FTIR спектрофотометър (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA), оборудван с универсален ATR аксесоар за вземане на проби (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Средните стойности на сигнала бяха получени от 16 сканирания с резолюция 4 cm2 в честотния диапазон 4000-600 cm2.
Морфологията на сухите инсулинови наночастици беше оценена чрез SEM изображения на лиофилизирани и спрей-сушени инсулинови наночастици, заснети от Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, USA). Основните използвани параметри бяха напрежение 5 keV и ток 30 mA.
Всички дехидратирани инсулинови наночастици (NPs) бяха разтворени отново в дехидратирана вода. Размерът на частиците, PDI, EE и LC бяха тествани отново, използвайки същия метод, споменат по-рано, за да се оцени тяхното качество след дехидратация. Стабилността на анхидроинсулиновите NPs също беше измерена чрез тестване на свойствата на NPs след продължително съхранение. В това проучване всички NPs след дехидратация бяха съхранявани в хладилник в продължение на три месеца. След три месеца съхранение, NPs бяха тествани за морфологичен размер на частиците, PDI, EE и LC.
Разтворете 5 mL от реконституираните наночастици в 45 mL, съдържащи симулирана стомашна течност (pH 1,2, съдържаща 1% пепсин), чревна течност (pH 6,8, съдържаща 1% трипсин) или разтвор на химотрипсин (100 g/mL, във фосфатен буфер, pH 7,8), за да оцените ефикасността на инсулина в защитата на наночастиците след дехидратация. Те бяха инкубирани при 37°C със скорост на разбъркване 100 rpm. 500 μL от разтвора бяха събрани в различни времеви точки и концентрацията на инсулин беше определена чрез HPLC.
Поведението на освобождаване in vitro на прясно приготвени и дехидратирани инсулинови наночастици (NPs) беше тествано чрез метода на диализния торбик (гранично молекулно тегло 100 kDa, Spectra Por Inc.). Прясно приготвените и реконституирани сухи NPs бяха диализирани в течности при pH 2,5, pH 6,6 и pH 7,0 (0,1 M фосфатно-буферен физиологичен разтвор, PBS), за да се симулира pH средата съответно на стомаха, дванадесетопръстника и горната част на тънките черва. Всички проби бяха инкубирани при 37 °C с непрекъснато разклащане при 200 rpm. Аспирирайте течността извън 5 mL диализния торбик в следните моменти: 0,5, 1, 2, 3, 4 и 6 часа и незабавно допълнете обема с пресен диализат. Замърсяването с инсулин в течността беше анализирано чрез HPLC, а скоростта на освобождаване на инсулин от наночастиците беше изчислена от съотношението на освободения свободен инсулин към общия инсулин, капсулиран в наночастиците (Уравнение 3).
Клетъчната линия HepG2 на човешки хепатоцелуларен карцином беше култивирана в блюда с диаметър 60 mm, използвайки Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), съдържаща 10% фетален говежди серум, 100 IU/mL пеницилин и 100 μg/mL стрептомицин29. Културите бяха поддържани при 37°C, 95% относителна влажност и 5% CO2. За анализи на поглъщане, HepG2 клетки бяха посяти при 1 × 105 клетки/ml върху 8-ямкова система за слайдове Nunc Lab-Tek (Thermo Fisher, NY, USA). За анализи на цитотоксичност, те бяха посяти в 96-ямкови плаки (Corning, NY, USA) при плътност 5 × 104 клетки/ml.
MTT анализът беше използван за оценка на цитотоксичността на прясно приготвени и дехидратирани инсулинови наночастици30. HepG2 клетки бяха посяти в 96-ямкови плаки с плътност 5 × 104 клетки/mL и култивирани в продължение на 7 дни преди тестването. Инсулиновите наночастици бяха разредени до различни концентрации (от 50 до 500 μg/mL) в културална среда и след това приложени към клетките. След 24 часа инкубация, клетките бяха промити 3 пъти с PBS и инкубирани със среда, съдържаща 0,5 mg/ml MTT, за допълнителни 4 часа. Цитотоксичността беше оценена чрез измерване на ензимната редукция на жълтия тетразолиев MTT до лилав формазан при 570 nm, използвайки Tecan infinite M200 pro спектрофотометър за плаки (Tecan, Männedorf, Швейцария).
Ефективността на клетъчното усвояване на наночастиците (NPs) беше тествана чрез конфокална лазерна сканираща микроскопия и анализ с флоуцитометрия. Всяка ямка на системата с камерни слайдове Nunc Lab-Tek беше третирана със свободен FITC-инсулин, наночастици, заредени с FITC-инсулин, и реконституирани 25 μg/mL дехидратирани FITC-инсулинови наночастици в същата концентрация и инкубирана в продължение на 4 часа. Клетките бяха промити 3 пъти с PBS и фиксирани с 4% параформалдехид. Ядрата бяха оцветени с 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Локализацията на инсулина беше наблюдавана с помощта на лазерно сканиращ/двуфотонен конфокален микроскоп Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Japan). За анализ с флоуцитометрия, същите концентрации от 10 μg/mL свободен FITC-инсулин, наночастици, заредени с FITC-инсулин, и ресолюбилизирани дехидратирани FITC-инсулинови наночастици бяха добавени към 96-ямкови плаки, засети с HepG2 клетки, и инкубирани в продължение на 4 часа. След 4 часа инкубация, клетките бяха отстранени и промити 3 пъти с FBS. 5 × 10⁴ клетки на проба бяха анализирани с BD LSR II поточен цитометър (BD, Franklin Lakes, New Jersey, United States).
Всички стойности са изразени като средна стойност ± стандартно отклонение. Сравненията между всички групи са оценени с помощта на еднофакторен ANOVA или t-тест от IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, Ню Йорк, САЩ) и p < 0,05 е счетено за статистически значимо.
Това проучване демонстрира гъвкавостта и способността на спрей сушенето да дехидратира омрежени хитозан/TPP/инсулинови наночастици с по-добра реконституция в сравнение със стандартните методи за лиофилизиране, използващи обемни агенти или криопротектанти, и по-висок капацитет на натоварване. Оптимизираните инсулинови наночастици дават среден размер на частиците от 318 nm и ефективност на капсулиране от 99,4%. Резултатите от SEM и FTIR след дехидратация показват, че сферичната структура се запазва само в спрей сушени наночастици със и без манитол и лиофилизирани с манитол, но лиофилизираните наночастици без манитол се разлагат по време на дехидратацията. В теста за способност за реконституиране, инсулиновите наночастици, спрей сушени без манитол, показват най-малък среден размер на частиците и най-високо натоварване при реконституиране. Поведението на освобождаване на всички тези дехидратирани наночастици показва, че те се освобождават бързо в разтвори с pH = 2,5 и pH = 7 и са много стабилни в разтвор с pH = 6,5. В сравнение с други повторно разтворени дехидратирани наночастици, спрей сушените наночастици без манитол показват най-бързото освобождаване. освобождаване. Този резултат е в съответствие с наблюдавания при анализа на клетъчното поглъщане, тъй като спрей-сушените наночастици в отсъствието на манитол почти напълно запазват ефективността на клетъчно поглъщане на прясно приготвени наночастици. Тези резултати показват, че сухите инсулинови наночастици, приготвени чрез спрей сушене без манитол, са най-подходящи за по-нататъшна обработка в други безводни лекарствени форми, като например перорални таблетки или биоадхезивни филми.
Поради проблеми с интелектуалната собственост, генерираните и/или анализирани по време на настоящото проучване набори от данни не са публично достъпни, но са на разположение от съответните автори при разумно искане.
Каган, А. Диабет тип 2: социални и научни корени, медицински усложнения и последици за пациентите и други хора. (McFarlane, 2009).
Сингх, AP, Гуо, Y., Сингх, A., Сие, W. & Jiang, P. Развитието на капсулирането на инсулин: възможно ли е пероралното приложение сега? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Последни постижения в пероралните инсулин-заредени липозоми системи за лечение на диабет. Interpretation. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).