Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена CSS поддръжка. За най-добри резултати ви препоръчваме да използвате по-нова версия на браузъра си (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, показваме сайта без стилизиране или JavaScript.
Пропионовата киселина (PPA) се използва за изследване на ролята на митохондриалната дисфункция при неврологични разстройства, като например разстройство от аутистичния спектър. Известно е, че PPA нарушава митохондриалната биогенеза, метаболизъм и оборот. Въпреки това, ефектите на PPA върху митохондриалната динамика, деленето и сливането остават проблематични поради сложния времеви характер на тези механизми. Тук използваме допълнителни количествени техники за изобразяване, за да изследваме как PPA влияе върху митохондриалната ултраструктура, морфология и динамика в невроноподобни SH-SY5Y клетки. PPA (5 mM) причинява значително намаляване на митохондриалната площ (p < 0,01), диаметъра и обиколката на Feret (p < 0,05) и площ 2 (p < 0,01). Анализът на локатора на митохондриални събития показва значително увеличение (p < 0,05) на събитията на делене и сливане, като по този начин се поддържа целостта на митохондриалната мрежа при стресови условия. В допълнение, експресията на мРНК на cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) и OPA1 (p < 0,05) беше значително намалена. 01). Това илюстрира ремоделирането на митохондриалната морфология, биогенеза и динамика за поддържане на функцията при стресови условия. Нашите данни предоставят нова представа за ефектите на PPA върху митохондриалната динамика и подчертават полезността на образните техники за изучаване на сложните регулаторни механизми, участващи в митохондриалните стрес реакции.
Митохондриите са неразделни участници в различни клетъчни функции, извън типичните им роли в производството на енергия и биосинтеза. Митохондриалният метаболизъм е ключов регулатор на калциевата сигнализация, метаболитната и редокс хомеостазата, възпалителната сигнализация, епигенетичните модификации, клетъчната пролиферация, диференциация и програмираната клетъчна смърт1. По-специално, митохондриалният метаболизъм е от решаващо значение за развитието, оцеляването и функцията на невроните и е широко замесен в различни прояви на невропатология2,3,4.
През последното десетилетие метаболитният статус се очерта като централен регулатор на неврогенезата, диференциацията, съзряването и пластичността5,6. Напоследък митохондриалната морфология и динамика се превърнаха в особено важни компоненти на митозата, динамичен процес, който поддържа набор от здрави митохондрии в клетките. Митохондриалната динамика се регулира от сложни взаимозависими пътища, вариращи от митохондриална биогенеза и биоенергетика до митохондриално делене, сливане, транспорт и клирънс7,8. Нарушаването на който и да е от тези интегративни механизми нарушава поддържането на здрави митохондриални мрежи и има дълбоки функционални последици за невроразвитието9,10. Всъщност, дисрегулация на митохондриалната динамика се наблюдава при много психиатрични, невродегенеративни и невроразвитийни разстройства, включително разстройства от аутистичния спектър (РАС)11,12.
Разстройство от аутистичния спектър (РАС) е хетерогенно невроразвитийно разстройство със сложна генетична и епигенетична архитектура. Наследствеността на РАС е безспорна, но основната молекулярна етиология остава слабо проучена. Натрупващите се данни от предклинични модели, клинични проучвания и мулти-омични молекулярни набори от данни предоставят все повече доказателства за митохондриална дисфункция при РАС13,14. Преди това проведохме скрининг за метилиране на ДНК в целия геном в кохорта от пациенти с РАС и идентифицирахме диференциално метилирани гени, групирани по протежение на митохондриалните метаболитни пътища15. Впоследствие съобщихме за диференциално метилиране на централните регулатори на митохондриалната биогенеза и динамика, което беше свързано с увеличен брой копия на mtDNA и променен метаболитен профил в урината при РАС16. Нашите данни предоставят все повече доказателства, че митохондриалната динамика и хомеостазата играят централна роля в патофизиологията на РАС. Следователно, подобряването на механистичното разбиране на връзката между митохондриалната динамика, морфологията и функцията е ключова цел на текущите изследвания на неврологичните заболявания, характеризиращи се с вторична митохондриална дисфункция.
Молекулярните техники често се използват за изучаване на ролята на специфични гени в митохондриалните стрес реакции. Този подход обаче може да бъде ограничен от многостранния и времеви характер на митотичните контролни механизми. Освен това, диференциалната експресия на митохондриалните гени е косвен индикатор за функционални промени, особено след като обикновено се анализират само ограничен брой гени. Следователно, са предложени по-директни методи за изучаване на митохондриалната функция и биоенергетика17. Митохондриалната морфология е тясно свързана с митохондриалната динамика. Формата, свързаността и структурата на митохондриите са критични за производството на енергия и оцеляването на митохондриите и клетките5,18. Освен това, различните компоненти на митозата се фокусират върху промените в митохондриалната морфология, които могат да служат като полезни крайни точки на митохондриалната дисфункция и да осигурят основа за последващи механистични изследвания.
Митохондриалната морфология може да бъде директно наблюдавана с помощта на трансмисионна електронна микроскопия (ТЕМ), което позволява детайлно изучаване на клетъчната ултраструктура. ТЕМ директно визуализира морфологията, формата и структурата на митохондриалните кристи при разделянето на отделните митохондрии, вместо да се разчита единствено на генната транскрипция, протеиновата експресия или митохондриалните функционални параметри в клетъчните популации17,19,20. В допълнение, ТЕМ улеснява изучаването на взаимодействията между митохондриите и други органели, като ендоплазмения ретикулум и автофагозомите, които играят ключова роля в митохондриалната функция и хомеостазата21,22. По този начин, това прави ТЕМ добра отправна точка за изучаване на митохондриалната дисфункция, преди да се фокусираме върху специфични пътища или гени. Тъй като митохондриалната функция става все по-актуална за невропатологията, има ясна необходимост от директно и количествено изучаване на митохондриалната морфология и динамика в in vitro невронни модели.
В тази статия разглеждаме митохондриалната динамика в невронален модел на митохондриална дисфункция при разстройство от аутистичния спектър. По-рано съобщихме за диференциално метилиране на пропионил-CoA карбоксилаза бета (PCCB) в ASD15, субединица на митохондриалния пропионил-CoA карбоксилазен ензим PCC. Известно е, че дисрегулацията на PCC причинява токсично натрупване на пропионилни производни, включително пропионова киселина (PPA)23,24,25. Доказано е, че PPA нарушава невроналния метаболизъм и променя поведението in vivo и е установен животински модел за изучаване на невроразвойните механизми, участващи в ASD26,27,28. Освен това е съобщено, че PPA нарушава потенциала на митохондриалната мембрана, биогенезата и дишането in vitro и е широко използвана за моделиране на митохондриална дисфункция в невроните29,30. Въпреки това, въздействието на индуцираната от PPA митохондриална дисфункция върху морфологията и динамиката на митохондриите остава слабо разбрано.
Това проучване използва допълнителни техники за изобразяване, за да определи количествено ефектите на PPA върху морфологията, динамиката и функцията на митохондриите в SH-SY5Y клетки. Първо, разработихме TEM метод за визуализиране на промените в митохондриалната морфология и ултраструктура17,31,32. Като се има предвид динамичният характер на митохондриите33, използвахме и анализ на локализатор на митохондриални събития (MEL), за да определим количествено промените в баланса между събитията на делене и сливане, броя и обема на митохондриите при PPA стрес. Накрая, изследвахме дали морфологията и динамиката на митохондриите са свързани с промени в експресията на гени, участващи в биогенезата, деленето и сливането. Взети заедно, нашите данни илюстрират предизвикателството да се изясни сложността на механизмите, регулиращи митохондриалната динамика. Подчертаваме полезността на TEM при изучаване на митохондриалната морфология като измерима конвергентна крайна точка на митозата в SH-SY5Y клетки. Освен това, подчертаваме, че TEM данните предоставят най-богатата информация, когато се комбинират с техники за изобразяване, които също така улавят динамични събития в отговор на метаболитен стрес. По-нататъшното характеризиране на молекулярните регулаторни механизми, които поддържат митозата на невронните клетки, може да предостави важна информация за митохондриалния компонент на нервната система и невродегенеративните заболявания.
За да се индуцира митохондриален стрес, SH-SY5Y клетките бяха третирани с PPA, използвайки 3 mM и 5 mM натриев пропионат (NaP). Преди TEM, пробите бяха подложени на криогенна подготовка на пробите, използвайки замразяване под високо налягане и допълнително замразяване (фиг. 1a). Разработихме автоматизиран конвейер за анализ на митохондриални изображения, за да измерим осем морфологични параметъра на митохондриалните популации в три биологични повторения. Установихме, че третирането с PPA значително промени четири параметъра: площ 2, площ, периметър и диаметър на Feret (фиг. 1b-e). Площ 2 намаля значително както при третиране с 3 mM, така и с 5 mM PPA (p = 0,0183 и p = 0,002, съответно) (фиг. 1b), докато площта (p = 0,003), периметърът (p = 0,0106) и диаметърът на Feret намаляха значително. Наблюдавано е значително намаление (p = 0,0172) в групата, третирана с 5 mM, в сравнение с контролната група (фиг. 1c-e). Значително намаляване на площта и обиколката показа, че клетките, третирани с 5 mM PPA, имат по-малки, по-закръглени митохондрии и че тези митохондрии са по-малко удължени от тези в контролните клетки. Това е в съответствие и със значително намаляване на диаметъра на Фере, независим параметър, показващ намаляване на най-голямото разстояние между ръбовете на частиците. Наблюдавани са промени в ултраструктурата на кристите: кристите стават по-слабо изразени под влияние на PPA стрес (фиг. 1а, панел Б). Не всички изображения обаче ясно отразяват ултраструктурата на кристите, така че не е извършен количествен анализ на тези промени. Тези TEM данни могат да отразяват три възможни сценария: (1) PPA усилва деленето или инхибира сливането, което води до свиване на размера на съществуващите митохондрии; (2) засилената биогенеза създава нови, по-малки митохондрии или (3) индуцира и двата механизма едновременно. Въпреки че тези състояния не могат да бъдат разграничени чрез TEM, значителните морфологични промени показват промени в митохондриалната хомеостаза и динамика при PPA стрес. Впоследствие изследвахме допълнителни параметри, за да характеризираме по-добре тази динамика и потенциалните механизми, които стоят в основата ѝ.
Пропионовата киселина (PPA) премоделира морфологията на митохондриите. (a) Представителни изображения от трансмисионна електронна микроскопия (TEM), показващи, че размерът на митохондриите намалява и митохондриите стават по-малки и по-закръглени с увеличаване на третирането с PPA; съответно 0 mM (нетретирани), 3 mM и 5 mM. Червените стрелки показват митохондриите. (b–e) SH-SY5Y клетки, третирани с PPA в продължение на 24 часа, бяха подготвени за TEM и резултатите бяха анализирани с помощта на Fiji/ImageJ. Четири от осемте параметъра показаха значителни разлики между контролните (нетретирани, 0 mM PPA) и третираните (3 mM и 5 mM PPA) клетки. (b) Регион 2, (c) Площ, (d) Периметър, (e) Диаметър на Ферет. Използвани са еднофакторен дисперсионен анализ (контрола спрямо третиране) и тест за множествено сравнение на Dunnett, за да се определят значимите разлики (p < 0,05). Точките данни представляват средната стойност на митохондриите за всяка отделна клетка, а лентите за грешки представляват средната стойност ± SEM. Показаните данни представляват n = 3, поне 24 клетки на повторение; анализирани са общо 266 изображения; * показва p < 0,05, ** показва p < 0,01.
За да характеризираме по-нататък как митохондриалната динамика реагира на PPA, оцветихме митохондриите с тетраметилродамин етилов естер (TMRE) и използвахме микроскопия с времетраене и MEL анализ, за ​​да локализираме и количествено определим митохондриите след 24 часа при 3 и 5 mM PPA. Третиране на събития на делене и сливане. (Фиг. 2а). След MEL анализа, митохондриите бяха допълнително анализирани, за да се определи количествено броят на митохондриалните структури и техният среден обем. Наблюдавахме малко, но значително увеличение на броя на събитията на делене, настъпващи при 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] в сравнение с събитията на делене [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] и сливане [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] и сливане [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] (<0.05)], като събитията бяха значително увеличени при 5 mM в сравнение с контролата (Фиг. 3б). Броят на митохондриите се е увеличил значително както при 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)], така и при 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (фиг. 3в), докато средният обем на всяка митохондриална структура е останал непроменен (фиг. 3в). Взети заедно, това предполага, че ремоделирането на митохондриалната динамика служи като компенсаторен отговор, който успешно поддържа целостта на митохондриалната мрежа. Увеличението на броя на събитията на делене при 3 mM PPA предполага, че увеличението на броя на митохондриите се дължи отчасти на митохондриалното делене, но като се има предвид, че средният обем на митохондриите остава по същество непроменен, биогенезата не може да бъде изключена като допълнителен компенсаторен отговор. Тези данни обаче са в съответствие с по-малките, кръгли митохондриални структури, наблюдавани чрез TEM, и също така демонстрират значителни промени в митохондриалната динамика, индуцирани от PPA.
Пропионовата киселина (PPA) индуцира динамично митохондриално ремоделиране, за да се поддържа целостта на мрежата. SH-SY5Y клетките бяха култивирани, третирани с 3 и 5 mM PPA в продължение на 24 часа и оцветени с TMRE и Hoechst 33342, последвано от MEL анализ. (a) Представителни изображения от микроскопия с ускорен кадър, изобразяващи цветни и бинаризирани проекции на максимална интензивност във време 2 (t2) за всяко условие. Избраните региони, посочени във всяко бинарно изображение, са подобрени и показани в 3D в три различни времеви рамки (t1-t3), за да се илюстрира динамиката във времето; събитията на сливане са маркирани в зелено; събитията на делене са маркирани в зелено. Показани са в червено. (b) Среден брой динамични събития за условие. (c) Среден брой митохондриални структури на клетка. (d) Среден обем (µm3) на всяка митохондриална структура на клетка. Показаните данни са представителни за n = 15 клетки на третирана група. Показаните грешки представляват средна стойност ± SEM, скалата = 10 μm, * p < 0,05.
Пропионовата киселина (PPA) причинява транскрипционно потискане на гени, свързани с митохондриалната динамика. SH-SY5Y клетките бяха третирани с 3 и 5 mM PPA в продължение на 24 часа. Относителното количествено определяне на гените беше извършено с помощта на RT-qPCR и нормализирано към B2M. Гени за митохондриална биогенеза (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 и (d) NFE2L2. Гени за митохондриално сливане и делене (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 и (i) DRP1. Значителни разлики (p < 0,05) бяха тествани с помощта на еднофакторен ANOVA (контрола срещу лечение) и тест за множествено сравнение на Dunnett: * показва p < 0,05, ** показва p < 0,01, а **** показва p < 0,0001. Стълбовете представляват средна експресия ± SEM. Показаните данни представляват n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) и n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) биологични реплики.
Данните от TEM и MEL анализите заедно показват, че PPA променя морфологията и динамиката на митохондриите. Тези техники за изобразяване обаче не дават представа за основните механизми, движещи тези процеси. Затова изследвахме експресията на мРНК на девет ключови регулатора на митохондриалната динамика, биогенезата и митозата в отговор на лечение с PPA. Количествено определихме онкогена на клетъчния миелом (cMYC), ядрения респираторен фактор (NRF1), митохондриалния транскрипционен фактор 1 (TFAM), NFE2-подобния транскрипционен фактор BZIP (NFE2L2), гастрин-подобния протеин 2 (STOML2), атрофията на зрителния нерв 1 (OPA1), Митофузин 1 (MFN1), Митофузин 2 (MFN2) и динамин-свързания протеин 1 (DRP1) след 24 часа лечение с 3 mM и 5 mM PPA. Наблюдавахме третиране с PPA в концентрация от 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 и p < 0,0001, съответно) и 5 ​​mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) (фиг. 3a-c). Намаляването на експресията на mRNA беше дозозависимо: експресията на cMYC, NRF1 и TFAM намаля съответно с 5,7, 2,6 и 1,9 пъти при 3 mM и с 11,2, 3 и 2,2 пъти при 5 mM. За разлика от това, централният ген за редокс биогенеза NFE2L2 не се промени при никаква концентрация на PPA, въпреки че се наблюдава подобна дозозависима тенденция на намалена експресия (фиг. 3d).
Също така изследвахме експресията на класически гени, участващи в регулацията на деленето и сливането. Смята се, че STOML2 участва в сливането, митофагията и биогенезата, като експресията му беше значително намалена (p < 0,0001) при 3 mM (2,4-кратна промяна) и 5 ​​mM (2,8-кратна промяна) PPA (фиг. 1). 3d). По подобен начин, експресията на гена за сливане OPA1 беше намалена при 3 mM (1,6-кратна промяна) и 5 ​​mM (1,9-кратна промяна) PPA (съответно p = 0,006 и p = 0,0024) (фиг. 3f). Въпреки това, не открихме значителни разлики в експресията на гените за сливане MFN1, MFN2 или гена за делене DRP1 при 24-часов PPA стрес (фиг. 3g–i). Освен това, открихме, че нивата на четири протеина, свързани с фузия и делене (OPA1, MFN1, MFN2 и DRP1), не се променят при едни и същи условия (фиг. 4a-d). Важно е да се отбележи, че тези данни отразяват един единствен момент във времето и може да не отразяват промените в експресията или нивата на активност на протеините по време на ранните етапи на PPA стрес. Значителното намаляване на експресията на cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 и OPA1 обаче показва значителна транскрипционна дисрегулация на митохондриалния метаболизъм, биогенезата и динамиката. В допълнение, тези данни подчертават полезността на образните техники за директно изследване на промените в крайното състояние на митохондриалната функция.
Нивата на протеини на сливане и делителни фактори не се промениха след третиране с пропионова киселина (PPA). SH-SY5Y клетките бяха третирани с 3 и 5 mM PPA в продължение на 24 часа. Нивата на протеини бяха количествено определени чрез Western blot анализ, а нивата на експресия бяха нормализирани спрямо общия протеин. Показани са средната експресия на протеини и представителни Western blot резултати на целевия и общия протеин. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Стълбовете представляват средна стойност ± SEM, а показаните данни са представителни за n = 3 биологични повторения. Множествени сравнения (p < 0,05) бяха извършени с помощта на еднофакторен дисперсионен анализ и тест на Dunnett. Оригиналният гел и блот са показани на Фигура S1.
Митохондриалната дисфункция е свързана с мултисистемни заболявания, вариращи от метаболитни, сърдечно-съдови и мускулни до неврологични заболявания1,10. Много невродегенеративни и невродегенеративни заболявания са свързани с митохондриална дисфункция, което подчертава значението на тези органели през целия живот на мозъка. Тези заболявания включват болестта на Паркинсон, болестта на Алцхаймер и разстройства от аутистичния спектър3,4,18. Достъпът до мозъчна тъкан за изучаване на тези заболявания обаче е труден, особено на механистично ниво, което прави клетъчните моделни системи необходима алтернатива. В това проучване използваме клетъчна моделна система, използваща третирани с PPA SH-SY5Y клетки, за да обобщим митохондриалната дисфункция, наблюдавана при невронни заболявания, по-специално разстройства от аутистичния спектър. Използването на този PPA модел за изучаване на митохондриалната динамика в невроните може да даде представа за етиологията на разстройствата от аутистичния спектър.
Проучихме възможността за използване на TEM за наблюдение на промените в митохондриалната морфология. Важно е да се отбележи, че TEM трябва да се използва правилно, за да се увеличи максимално неговата ефективност. Приготвянето на криообразувания позволява по-добро запазване на невронните структури чрез едновременно фиксиране на клетъчни компоненти и намаляване на образуването на артефакти34. В съответствие с това, наблюдавахме, че невроноподобните SH-SY5Y клетки имат непокътнати субклетъчни органели и удължени митохондрии (фиг. 1а). Това подчертава полезността на криогенните техники за подготовка за изучаване на митохондриалната морфология в невронни клетъчни модели. Въпреки че количествените измервания са критични за обективния анализ на TEM данните, все още няма консенсус относно това какви специфични параметри трябва да се измерват, за да се потвърдят митохондриалните морфологични промени. Въз основа на голям брой изследвания, които количествено са изследвали митохондриалната морфология17,31,32, разработихме автоматизиран конвейер за анализ на митохондриални изображения, който измерва осем морфологични параметъра, а именно: площ, площ2, съотношение на страните, периметър, кръговост, степен, диаметър на Фере и кръговост.
Сред тях, PPA значително намалява площ 2, площ, периметър и диаметър на Feret (фиг. 1b-e). Това показва, че митохондриите стават по-малки и по-закръглени, което е в съответствие с предишни проучвания, показващи намаляване на митохондриалната площ след 72 часа митохондриален стрес, индуциран от PPA30. Тези морфологични характеристики могат да показват митохондриално делене, необходим процес за секвестиране на увредени компоненти от митохондриалната мрежа, за да се насърчи тяхното разграждане чрез митофагия35,36,37. От друга страна, намаляването на средния размер на митохондриите може да е свързано с повишена биогенеза, което води до образуването на малки зараждащи се митохондрии. Увеличеното делене или биогенеза представлява компенсаторна реакция за поддържане на митозата срещу митохондриален стрес. Въпреки това, намаленият растеж на митохондриите, нарушеното сливане или други състояния не могат да бъдат изключени.
Въпреки че изображенията с висока резолюция, създадени чрез TEM, позволяват определянето на морфологични характеристики на ниво отделни митохондрии, този метод произвежда двуизмерни снимки в един момент от времето. За да изследваме динамичните реакции на метаболитен стрес, оцветихме митохондриите с TMRE и използвахме time-lapse микроскопия с MEL анализ, който позволява високопроизводителна 3D визуализация на промените в митохондриалната мрежа във времето33,38. Наблюдавахме фини, но значителни промени в динамиката на митохондриите при PPA стрес (фиг. 2). При 3 mM броят на събитията на делене се увеличи значително, докато събитията на сливане останаха същите като в контролата. Увеличение на броя както на събитията на делене, така и на сливане се наблюдава при 5 mM PPA, но тези промени бяха приблизително пропорционални, което предполага, че кинетиката на делене и сливане достига равновесие при по-високи концентрации (фиг. 2b). Средният обем на митохондриите остана непроменен както при 3, така и при 5 mM PPA, което показва, че целостта на митохондриалната мрежа е запазена (фиг. 2d). Това отразява способността на динамичните митохондриални мрежи да реагират на лек метаболитен стрес, за да поддържат ефективно хомеостазата, без да причиняват фрагментация на мрежата. При 3 mM PPA, увеличаването на деленето е достатъчно, за да насърчи прехода към ново равновесие, но е необходимо по-дълбоко кинетично ремоделиране в отговор на стрес, предизвикан от по-високи концентрации на PPA.
Броят на митохондриите се е увеличил и при двете концентрации на PPA стрес, но средният обем на митохондриите не се е променил значително (фиг. 2в). Това може да се дължи на повишена биогенеза или увеличено делене; обаче, при липса на значително намаление на средния обем на митохондриите, е по-вероятно биосинтезата да се увеличи. Данните на Фигура 2 обаче подкрепят съществуването на два компенсаторни механизма: увеличаване на броя на събитията на делене, съответстващо на повишена регулация на митохондриалното делене, и увеличаване на броя на събитията, съответстващо на митохондриалната биогенеза. В крайна сметка, динамичната компенсация за лек стрес може да се състои от едновременни процеси, включващи делене, сливане, биогенеза и митофагия. Въпреки че предишни автори са показали, че PPA усилва митозата30,39 и митофагията29, ние предоставяме доказателства за ремоделиране на динамиката на митохондриалното делене и сливане в отговор на PPA. Тези данни потвърждават морфологичните промени, наблюдавани чрез TEM, и предоставят допълнителна информация за механизмите, свързани с индуцираната от PPA митохондриална дисфункция.
Тъй като нито TEM, нито MEL анализът предоставиха директни доказателства за генните регулаторни механизми, лежащи в основата на наблюдаваните морфологични промени, ние изследвахме РНК експресията на гени, участващи в митохондриалния метаболизъм, биогенезата и динамиката. cMYC протоонкогенът е транскрипционен фактор, участващ в регулацията на митохондриите, гликолизата, метаболизма на аминокиселините и мастните киселини40. Освен това е известно, че cMYC регулира експресията на близо 600 митохондриални гена, участващи в митохондриалната транскрипция, транслация и сглобяване на комплекси, включително NRF1 и TFAM41. NRF1 и TFAM са два централни регулатора на митозата, действащи надолу по веригата от PGC-1α, за да активират репликацията на mtDNA. Този път се активира от cAMP и AMPK сигнализацията и е чувствителен към енергиен разход и метаболитен стрес. Изследвахме също NFE2L2, редокс регулатор на митохондриалната биогенеза, за да определим дали ефектите на PPA могат да бъдат медиирани от оксидативен стрес.
Въпреки че експресията на NFE2L2 остана непроменена, открихме постоянно дозозависимо намаление на експресията на cMYC, NRF1 и TFAM след 24 часа лечение с 3 mM и 5 mM PPA (Фиг. 3a-c). Понижаването на експресията на cMYC е било съобщавано преди това като отговор на митохондриален стрес42 и обратно, понижаването на експресията на cMYC може да причини митохондриална дисфункция чрез ремоделиране на митохондриалния метаболизъм, мрежовата свързаност и мембранната поляризация43. Интересното е, че cMYC участва и в регулирането на митохондриалното делене и сливане42,43 и е известно, че увеличава фосфорилирането на DRP1 и митохондриалната локализация по време на клетъчното делене44, както и медиира митохондриалното морфологично ремоделиране в невронните стволови клетки45. Всъщност, cMYC-дефицитните фибробласти показват намален размер на митохондриите, което е в съответствие с промените, предизвикани от PPA43 стрес. Тези данни илюстрират интересна, но все още неясна връзка между cMYC и митохондриалната динамика, предоставяйки интересна цел за бъдещи изследвания на ремоделирането, индуцирано от PPA стрес.
Намаляването на NRF1 и TFAM е в съответствие с ролята на cMYC като важен транскрипционен активатор. Тези данни са в съответствие и с предишни проучвания върху човешки ракови клетки на дебелото черво, показващи, че PPA намалява експресията на NRF1 mRNA на 22-ия час, което е свързано с изчерпване на АТФ и повишаване на ROS46. Тези автори също така съобщават, че експресията на TFAM се увеличава на 8,5 часа, но се връща до изходните нива на 22-ия час. За разлика от това, Kim et al. (2019) показват, че експресията на TFAM mRNA е значително намалена след 4 часа PPA стрес в SH-SY5Y клетки; след 72 часа обаче експресията на TFAM протеин е значително повишена и броят на копията на mtDNA е значително увеличен. По този начин, намаляването на броя на гените за митохондриална биогенеза, което наблюдавахме след 24 часа, не изключва възможността увеличението на броя на митохондриите да е свързано с активиране на биогенезата в по-ранни времеви точки. Предишни проучвания показват, че PPA значително повишава регулацията на PGC-1α mRNA и протеина в SH-SY5Y клетки на 4 часа и 30 минути, докато пропионовата киселина усилва митохондриалната биогенеза в телешките хепатоцити чрез PGC-1α на 12 часа и 39 минути. Интересното е, че PGC-1α е не само директен транскрипционен регулатор на NRF1 и TFAM, но е доказано, че регулира и активността на MFN2 и DRP1 чрез регулиране на деленето и сливането47. Взети заедно, това подчертава тясното свързване на механизмите, регулиращи митохондриалните компенсаторни отговори, индуцирани от PPA. Освен това, нашите данни отразяват значителна дисрегулация на транскрипционната регулация на биогенезата и метаболизма при стрес от PPA.
Гените STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 и DRP1 са сред централните регулатори на митохондриалното делене, сливане и динамика37,48,49. Има много други гени, участващи в митохондриалната динамика, но преди това е установено, че STOML2, OPA1 и MFN2 са диференциално метилирани в кохорти с ASD16 и няколко независими проучвания съобщават за промени в тези транскрипционни фактори в отговор на митохондриален стрес50,51.52. Експресията както на OPA1, така и на STOML2 е значително намалена чрез третиране с 3 mM и 5 mM PPA (фиг. 3e, f). OPA1 е един от класическите регулатори на митохондриалното сливане чрез директно взаимодействие с MFN1 и 2 и играе роля в ремоделирането на кристите и митохондриалната морфология53. Точната роля на STOML2 в митохондриалната динамика остава неясна, но доказателствата сочат, че той играе роля в митохондриалното сливане, биогенезата и митофагията.
STOML2 участва в поддържането на митохондриалното респираторно свързване и образуването на дихателни верижни комплекси54,55 и е доказано, че променя дълбоко метаболитните характеристики на раковите клетки56. Проучвания показват, че STOML2 насърчава потенциала на митохондриалната мембрана и биогенезата чрез взаимодействие с BAN и кардиолипин 55, 57, 58. Освен това, независими проучвания показват, че взаимодействието между STOML2 и PINK1 регулира митофагията59,60. Забележително е, че е съобщено, че STOML2 директно взаимодейства и стабилизира MFN2, а също така играе важна роля в стабилизирането на дългите OPA1 изоформи чрез инхибиране на протеазата, отговорна за разграждането на OPA153,61,62. Намаляването на експресията на STOML2, наблюдавано в PPA реакции, може да направи тези фузионни протеини по-податливи на разграждане чрез убиквитин- и протеазом-зависими пътища48. Въпреки че точната роля на STOML2 и OPA1 в динамичния отговор на PPA е неясна, намалената експресия на тези гени за сливане (Фигура 3) може да наруши баланса между деленето и сливането и да доведе до намаляване на размера на митохондриите (Фигура 3). 1).
От друга страна, експресията на OPA1 протеина остава непроменена след 24 часа, докато нивата на mRNA и протеините на MFN1, MFN2 или DRP1 не се променят значително след третиране с PPA (фиг. 3g-i, фиг. 4). Това може да показва, че няма промени в регулацията на тези фактори, участващи в митохондриалното сливане и делене. Струва си да се отбележи обаче, че всеки от тези четири гена се регулира и от посттранскрипционни модификации (PTM), които контролират протеиновата активност. OPA1 има осем алтернативни сплайс варианта, които се протеолитично разцепват в митохондриите, за да се получат две различни изоформи 63. Балансът между дългите и късите изоформи в крайна сметка определя ролята на OPA1 в митохондриалното сливане и поддържането на митохондриалната мрежа 64. Активността на DRP1 се регулира от фосфорилирането на калций/калмодулин-зависима протеин киназа II (CaMKII), докато разграждането на DRP1 се регулира от убиквитиниране и SUMOylation 65. Накрая, както DRP1, така и MFN1/2 са GTPases, така че активността може да бъде повлияна от скоростта на производство на GTP в митохондриите 66. Следователно, въпреки че експресията на тези протеини остава постоянна, това може да не отразява непроменена протеинова активност или локализация 67,68. Всъщност, съществуващите PTM протеинови репертоари често служат като първа линия на защита, отговорна за медиирането на остри стрес реакции. При наличие на умерен метаболитен стрес в нашия модел е вероятно PTM да насърчава повишена активност на протеините на сливане и делене, за да възстанови достатъчно митохондриалната цялост, без да се изисква допълнително активиране на тези гени на ниво mRNA или протеин.
Взети заедно, горните данни подчертават сложната и зависима от времето регулация на митохондриалната морфология и предизвикателствата пред изясняването на тези механизми. За да се изследва генната експресия, първо е необходимо да се идентифицират специфични целеви гени в пътя. Нашите данни обаче показват, че гените в един и същ път не реагират по един и същ начин на един и същ стрес. Всъщност, предишни проучвания са показали, че различните гени в един и същ път могат да проявяват различни профили на времеви отговор30,46. Освен това съществуват сложни посттранскрипционни механизми, които нарушават връзката между транскрипцията и генната функция. Протеомните изследвания могат да предоставят представа за въздействието на посттранскрипционните механизми и протеиновата функция, но те също така поставят предизвикателства, включително методи с ниска производителност, високи съотношения сигнал/шум и лоша разделителна способност.
В този контекст, изучаването на митохондриалната морфология с помощта на TEM и MEL има голям потенциал да отговори на фундаментални въпроси за връзката между митохондриалната динамика и функция и как това влияе върху заболяването. Най-важното е, че TEM предоставя директен метод за измерване на митохондриалната морфология като конвергентна крайна точка на митохондриална дисфункция и динамика51. MEL също така предоставя директен метод за визуализиране на събития на делене и сливане в триизмерна клетъчна среда, позволявайки количествено определяне на динамичното митохондриално ремоделиране дори при липса на промени в генната експресия33. Тук подчертаваме полезността на техниките за митохондриално изобразяване при вторични митохондриални заболявания. Тези заболявания обикновено се характеризират с хроничен лек метаболитен стрес, характеризиращ се с фино ремоделиране на митохондриалните мрежи, а не с остро митохондриално увреждане. Въпреки това, митохондриалната компенсация, необходима за поддържане на митозата при хроничен стрес, има дълбоки функционални последици. В контекста на невронауката, по-доброто разбиране на тези компенсаторни механизми може да предостави важна информация за плейотропната невропатология, свързана с митохондриалната дисфункция.
В крайна сметка, нашите данни подчертават полезността на образните техники за разбиране на функционалните последици от сложните взаимодействия между генната експресия, протеиновите модификации и протеиновата активност, които контролират невронната митохондриална динамика. Използвахме PPA, за да моделираме митохондриална дисфункция в невронален клетъчен модел, за да получим представа за митохондриалния компонент на ASD. SH-SY5Y клетки, третирани с PPA, показаха промени в митохондриалната морфология: митохондриите станаха малки и кръгли, а кристите бяха слабо дефинирани, когато се наблюдаваха чрез TEM. MEL анализът показва, че тези промени настъпват едновременно с увеличаване на събитията на делене и сливане, за да се поддържа митохондриалната мрежа в отговор на лек метаболитен стрес. Освен това, PPA значително нарушава транскрипционната регулация на митохондриалния метаболизъм и хомеостазата. Идентифицирахме cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 и OPA1 като ключови митохондриални регулатори, нарушени от PPA стрес, и може да играят роля в медиирането на PPA-индуцираните промени в митохондриалната морфология и функция. Необходими са бъдещи проучвания, за да се характеризират по-добре PPA-индуцираните времеви промени в генната експресия и протеиновата активност, локализацията и посттранслационните модификации. Нашите данни подчертават сложността и взаимозависимостта на регулаторните механизми, медииращи реакцията на митохондриалния стрес, и демонстрират полезността на TEM и други техники за изобразяване за по-целенасочени механистични изследвания.
Клетъчната линия SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) е закупена от Sigma-Aldrich. SH-SY5Y клетките са култивирани в модифицирана среда на Dulbecco/хранителна смес F-12 (DMEM/F-12) и L-глутамин (SC09411, ScienCell) в колби от 25 cm2, допълнени с 20% фетален говежди серум (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) и 1% пеницилин-стрептомицин (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) при 37°C, 5% CO2. Клетките са субкултивирани до 80% конфлуентност, използвайки 0.05% трипсин-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), центрофугирани при 300 g и посевани при плътност приблизително 7 × 105 клетки/ml. Всички експерименти са проведени върху недиференцирани SH-SY5Y клетки между пасажи 19–22. PPA се прилага като NaP. Разтваря се прахът NaP (CAS № 137-40-6, химична формула C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) в топла вода MilliQ до концентрация 1 M и се съхранява при 4 °C. В деня на третирането, този разтвор се разрежда с 1 M PPA до 3 mM и 5 mM PPA в безсерумна среда (DMEM/F-12 с L-глутамин). Концентрациите за третиране за всички експерименти са без PPA (0 mM, контрола), 3 mM и 5 mM PPA. Експериментите са проведени в поне три биологични повторения.
SH-SY5Y клетки бяха посяти в колби с обем 25 cm5 със скорост 5,5 × 105 клетки/ml и култивирани в продължение на 24 часа. PPA третирането беше добавено към колбата преди 24-часовата инкубация. Съберете клетъчните пелети, следвайки нормалните протоколи за субкултура на тъкани на бозайници (описани по-горе). Ресуспендирайте клетъчните пелети в 100 µl 2,5% глутаралдехид, 1× PBS и съхранявайте при 4°C до обработката. SH-SY5Y клетките бяха центрофугирани за кратко, за да се пелетизират клетките и да се отстрани 2,5% глутаралдехид, 1× PBS разтвор. Ресуспендирайте утайката в 4% агарозен гел, приготвен в дестилирана вода (съотношението на агарозата към обема на утайката е 1:1). Парчета агароза бяха поставени върху решетки върху плоски плочи и покрити с 1-хексадецен преди замразяване под високо налягане. Пробите бяха замразени в 100% сух ацетон при -90°C за 24 часа. След това температурата беше повишена до -80°C и беше добавен разтвор от 1% осмиев тетроксид и 0,1% глутаралдехид. Пробите бяха съхранявани при -80°C в продължение на 24 часа. След това температурата постепенно беше повишена до стайна температура в продължение на няколко дни: от –80°C до –50°C за 24 часа, до –30°C за 24 часа, до –10°C за 24 часа и накрая до стайна температура.
След криогенна подготовка, пробите бяха импрегнирани със смола и бяха направени ултратънки срези (∼100 nm) с помощта на ултрамикротом Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Срезите бяха оцветени с 2% уранил ацетат и оловен цитрат. Пробите бяха наблюдавани с помощта на трансмисионен електронен микроскоп FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (преди FEI), Айндховен, Холандия), работещ на 200 kV (предавател Lab6) и CCD камера Gatan (Gatan, Великобритания), оборудвана с енергиен филтър Tridiem.
Във всяко техническо повторение бяха получени поне 24 изображения на единични клетки, общо 266 изображения. Всички изображения бяха анализирани с помощта на макроса за регион на интерес (ROI) и макроса за митохондрии. Митохондриалният макрос е базиран на публикувани методи17,31,32 и позволява полуавтоматизирана пакетна обработка на TEM изображения във Fiji/ImageJ69. Накратко: изображението се инвертира и обръща, като се използва изваждане на фона на търкаляща се топка (радиус 60 пиксела) и FFT лентов филтър (използвайки съответно горна и долна граница от 60 и 8 пиксела) и потискане на вертикалните линии с толеранс на ориентация от 5%. Обработеното изображение автоматично се прагово определя, като се използва алгоритъм за максимална ентропия и се генерира двоична маска. Бяха извлечени области на изображението, свързани с ръчно избрани ROI в сурови TEM изображения, характеризиращи митохондриите и изключващи плазмената мембрана и други области с висок контраст. За всяка извлечена ROI бяха анализирани бинарни частици, по-големи от 600 пиксела, и площта на частиците, периметърът, главните и малките оси, диаметърът на Feret, закръглеността и кръглостта бяха измерени с помощта на вградените функции за измерване на Fiji/ImageJ. Следвайки Merrill, Flippo и Strack (2017), от тези данни бяха изчислени площ 2, съотношение на страните на частиците (съотношение между главните и малките оси) и фактор на формата (FF), където FF = периметър 2/4pi x площ. Дефиницията на параметричната формула може да бъде намерена в Merrill, Flippo и Strack (2017). Споменатите макроси са достъпни в GitHub (вижте Декларацията за наличност на данни). Средно приблизително 5600 частици бяха анализирани на PPA третиране, за общо приблизително 17 000 частици (данните не са показани).
SH-SH5Y клетките бяха поставени в 8-камерни културални блюда (ThermoFisher, #155411), за да се позволи адхезия за една нощ, и след това инкубирани с TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) и Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Изображенията бяха получени с помощта на 405 nm и 561 nm лазери в продължение на 10 минути, а суровите изображения бяха получени като z-stacks, съдържащи 10 микрографски изображения с az стъпка от 0,2 μm между кадрите на изображението в 12 последователни времеви точки. Изображенията бяха събрани с помощта на Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 платформа със суперрезолюция (Carl Zeiss, Oberkochen, Германия), използвайки LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 обектив. Изображенията бяха анализирани в ImageJ, използвайки предварително описан конвейер и плъгина ImageJ за измерване на събития на сливане и делене, среден брой митохондриални структури и среден митохондриален обем на клетка33. MEL макросите са достъпни в GitHub (вижте Декларацията за наличност на данни).
SH-SY5Y клетките бяха култивирани в шестямкови плаки при плътност 0,3 × 106 клетки/mL в продължение на 24 часа преди третирането. РНК беше екстрахирана, използвайки протокола Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) с леки модификации: добавете 300 μl РНК лизисен буфер към всяка ямка преди отстраняване и лизирайте всяка проба като последна стъпка с 30 μl вода без DNase/RNase елуиране. Всички проби бяха проверени за количество и качество, използвайки NanoDrop ND-1000 UV-Vis спектрофотометър. Общият протеин от клетъчните лизати беше получен, използвайки 200 μl RIPA лизисен буфер, а концентрацията на протеин беше определена количествено, използвайки Bradford protein assay70.
Синтезът на кДНК беше извършен с помощта на Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) съгласно инструкциите на производителя с някои модификации. кДНК беше синтезирана в 20-μl реакции, използвайки 0.7 до 1 μg тотална РНК. Праймерите бяха избрани от публикувани по-рано статии 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Таблица S1) и съпътстващите сонди бяха проектирани с помощта на инструмента PrimerQuest от Integrated DNA Technologies. Всички гени от интерес бяха нормализирани спрямо ядрения B2M ген. Генната експресия на STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC и OPA1 беше измерена чрез RT-qPCR. Мастер миксът включваше LUNA Taq полимераза (M3003L, New England Biolabs), 10 μM директни и обратни праймери, кДНК и вода с PCR качество, за да се получи краен обем от 10 μL за всяка реакция. Експресията на гените за делене и делене (DRP1, MFN1/2) беше измерена с помощта на TaqMan мултиплексни анализи. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) беше използвана съгласно инструкциите на производителя с малки модификации. Мултиплексната RT-qPCR мастер микс включва 1X LUNA Taq полимераза, 10 μM директни и обратни праймери, 10 μM сонда, кДНК и вода с PCR клас, което води до краен обем от 20 μL за всяка реакция. RT-qPCR беше проведена с помощта на Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - сериен номер: R0618110). Условията на циклиране са показани в Таблица S1. Всички кДНК проби бяха амплифицирани в три екземпляра и беше генерирана стандартна крива, използвайки серия от десетократни разреждания. Отклоненията в три екземпляра от пробите със стандартно отклонение на прага на цикъла (Ct) > 0,5 бяха премахнати от анализа, за да се осигури възпроизводимост на данните30,72. Относителната генна експресия беше изчислена с помощта на метода 2-ΔΔCt79.
Протеинови проби (60 μg) бяха смесени с Laemmli зареждащ буфер в съотношение 2:1 и анализирани върху 12% безцветен протеинов гел (Bio-Rad #1610184). Протеините бяха прехвърлени върху PVDF (поливинилиден флуорид) мембрана (#170-84156, Bio-Rad), използвайки системата Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Мембраната беше блокирана и инкубирана с подходящите първични антитела (OPA1, MFN1, MFN2 и DRP1) (разредени 1:1000) в продължение на 48 часа, последвано от инкубиране с вторични антитела (1:10 000) в продължение на 1 час. След това мембраните бяха изобразени с помощта на Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) и записани с помощта на Bio-Rad ChemiDoc MP система. За Western blot анализ беше използван ImageLab версия 6.1. Оригиналният гел и блот са показани на Фигура S1. Информация за антителата е предоставена в Таблица S2.
Наборите от данни са представени като средна стойност и стандартна грешка на средната стойност (SEM) на поне три независими извадки. Наборите от данни бяха тествани за нормалност, използвайки теста на Шапиро-Уилкс (освен ако не е посочено друго), преди да се приеме Гаусово разпределение и равни стандартни отклонения и да се продължи с анализите. В допълнение към анализа на набора от данни, за определяне на значимостта (p < 0,05) бяха използвани MEL LSD на Fisher, еднофакторен ANOVA (средна стойност за лечение спрямо контрола) и тест за множествено сравнение на Dunnett. Значимите p стойности са показани на графиката като *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Всички статистически анализи и графики бяха извършени и генерирани с помощта на GraphPad Prism 9.4.0.
Макросите Fiji/ImageJ за TEM анализ на изображения са публично достъпни в GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Макросът Mitochondrial Event Locator (MEL) е публично достъпен в GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Мейлиана А., Деви НМ и Виджая А. Митохондрии: главни регулатори на метаболизма, хомеостазата, стреса, стареенето и епигенетиката. Индонезийски. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Бен-Шахар, Д. Многостранна митохондриална дисфункция при шизофрения, комплекс I като възможна патологична мишена. Шизофрения. ресурс. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. и Beal, MF Митохондриална дисфункция при болестта на Паркинсон. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG и Mehta V. Стресирани митохондрии: мишени на инвазия при болестта на Алцхаймер. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF и Ferreira GK Митохондриите и мозъкът: биоенергетика и други. Neurotoxins. resource. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Плейотропни митохондрии: влиянието на митохондриите върху невроналното развитие и заболяванията. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. и Morais, VA Митохондриална биогенеза в невроните: как и къде. Международност. J. Mohr. Науката. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. и Zhao, J. Регулация на митохондриалната динамика при бозайниците: възможности и предизвикателства. front. endocrinic. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Хачо, М. и Слак, Р.С. Митохондриална динамика в регулацията на неврогенезата: от развиващия се до възрастен мозък. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).