Настоящ *Настоящ адрес: Кьолн 50931, Германия, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
Невродегенерацията на митохондриалните заболявания се счита за необратима, тъй като метаболитната пластичност на невроните е ограничена, но ефектът на митохондриалната дисфункция върху клетъчната автономност на невроналния метаболизъм в тялото е слабо проучен. Тук представяме клетъчно-специфичния протеом на Purkinje неврони с прогресиращ OXPHOS дефицит, причинен от нарушена динамика на митохондриалното сливане. Установихме, че митохондриалната дисфункция е предизвикала дълбока промяна в областта на протеомиката, което в крайна сметка е довело до последователно активиране на прецизни метаболитни програми преди клетъчната смърт. Неочаквано установихме очевидната индукция на пируват карбоксилаза (PCx) и други ензими против стареене, които допълват междинните продукти на TCA цикъла. Инхибирането на PCx изостря оксидативния стрес и невродегенерацията, което показва, че атеросклерозата има защитен ефект при неврони, лишени от OXPHOS. Възстановяването на митохондриалното сливане в терминално дегенерирани неврони напълно обръща тези метаболитни характеристики, като по този начин предотвратява клетъчната смърт. Нашите открития идентифицират неизвестни досега пътища, които придават устойчивост на митохондриалната дисфункция и показват, че невродегенерацията може да бъде обърната дори в късните стадии на заболяването.
Централната роля на митохондриите в поддържането на невроналния енергиен метаболизъм се подчертава от обширните неврологични симптоми, свързани с човешките митохондриални заболявания. Повечето от тези заболявания са причинени от генни мутации, които регулират митохондриалната генна експресия (1, 2) или разрушаване на гени, свързано с митохондриалната динамика, което косвено влияе върху стабилността на митохондриалната ДНК (мтДНК) (3, 4). Работата върху животински модели показва, че в отговор на митохондриална дисфункция в околните тъкани могат да се активират консервативни метаболитни пътища (5-7), което предоставя важна информация за задълбочено разбиране на патогенезата на тези сложни заболявания. В рязък контраст, нашето разбиране за метаболитните промени на специфични клетъчни типове, причинени от общия неуспех в производството на митохондриален аденозин трифосфат (АТФ) в мозъка, е фундаментално (8), което подчертава необходимостта от идентифициране на терапевтични цели, които могат да се използват за предотвратяване или предотвратяване на заболявания. Предотвратяване на невродегенерация (9). Липсата на информация е фактът, че нервните клетки се считат за много ограничена метаболитна гъвкавост в сравнение с клетъчните типове на околните тъкани (10). Като се има предвид, че тези клетки играят централна роля в координирането на доставката на метаболити към невроните, за да се насърчи синаптичното предаване и да се реагира на наранявания и болестни състояния, способността за адаптиране на клетъчния метаболизъм към предизвикателните условия на мозъчната тъкан е почти ограничена до глиалните клетки (11-14). Освен това, присъщата клетъчна хетерогенност на мозъчната тъкан до голяма степен възпрепятства изучаването на метаболитните промени, които настъпват в специфични невронни подгрупи. В резултат на това е известно малко за точните клетъчни и метаболитни последици от митохондриалната дисфункция в невроните.
За да разберем метаболитните последици от митохондриалната дисфункция, ние изолирахме Purkinje неврони (PNs) в различни стадии на невродегенерация, причинена от разрушаването на сливането на външната мембрана на митохондриите (Mfn2). Въпреки че Mfn2 мутациите при хората са свързани с форма на наследствена моторна сензорна невропатия, известна като Charcot-Marie-Tooth тип 2A (15), условното разрушаване на Mfn2 при мишки е добре познат метод за индуциране на окислително-фосфорилираща (OXPHOS) дисфункция. Различните невронни подтипове (16-19) и полученият невродегенеративен фенотип са съпроводени от прогресивни неврологични симптоми, като двигателни нарушения (18, 19) или церебеларна атаксия (16). Чрез използване на комбинация от количествена (LFQ) протеомика без етикети, метаболомика, образна диагностика и вирусологични методи, ние показваме, че прогресивната невродегенерация силно индуцира пируват карбоксилаза (PCx) и други фактори, участващи в артериосклерозата на PNs in vivo. Експресията на ензими. За да проверим релевантността на това откритие, ние специално понижихме експресията на PCx в Mfn2-дефицитни неврони и установихме, че тази операция влоши оксидативния стрес и ускори невродегенерацията, като по този начин доказа, че азооспермията води до клетъчна смърт. Тежката експресия на MFN2 може напълно да спаси терминалната дегенерация на неврони с тежък OXPHOS дефицит, масивна консумация на митохондриална ДНК и очевидно нарушена митохондриална мрежа, което допълнително подчертава, че тази форма на невродегенерация може да се възстанови дори в напреднал стадий на заболяването преди клетъчна смърт.
За да визуализираме митохондриите в невронните клетки с нокаут на Mfn2, използвахме щам на мишки, който позволява на Cre-зависимите митохондрии да се насочат към експресията на жълтия флуоресцентен протеин (YFP) (mtYFP) (20) Cre и проверихме морфологията на митохондриите in vivo. Установихме, че разрушаването на Mfn2 гена в невронните клетки води до постепенно разделяне на митохондриалната мрежа (Фигура S1A), като най-ранната промяна е установена на 3-седмична възраст. За разлика от това, значителната дегенерация на клетъчния слой на невронните клетки, както се вижда от загубата на имунооцветяване с калбиндин, не започва до 12-седмична възраст (Фигура 1, A и B). Несъответствието във времето между най-ранните промени в митохондриалната морфология и видимото начало на невронната смърт ни подтикна да изследваме метаболитните промени, предизвикани от митохондриалната дисфункция преди клетъчната смърт. Разработихме стратегия, базирана на флуоресцентно активирано клетъчно сортиране (FACS), за изолиране на YFP (YFP+)-експресиращи PN (Фигура 1C) и в контролни мишки (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), наричана по-долу CTRL (Фигура S1B). Оптимизацията на стратегията за гейтиране, базирана на относителния интензитет на YFP сигнала, ни позволява да пречистим YFP+ тялото (YFPhigh) на PN от не-PN (YFPneg) (Фигура S1B) или предполагаеми флуоресцентни аксонови/дендритни фрагменти (YFPlow; Фигура S1D, вляво), потвърдено чрез конфокален микроскоп (Фигура S1D, вдясно). За да проверим идентичността на класифицираната популация, проведохме LFQ протеомика и след това анализ на главните компоненти и установихме, че има ясно разделение между YFPhigh и YFPneg клетки (Фигура S1C). YFPhigh клетките показаха нетно обогатяване на известни PN маркери (т.е. Calb1, Pcp2, Grid2 и Itpr3) (21, 22), но не и обогатяване на протеини, обикновено експресирани в неврони или други клетъчни типове (Фигура 1D). Сравнение между проби в класифицирани YFPhigh клетки, събрани в независими експерименти, показа коефициент на корелация > 0,9, което демонстрира добра възпроизводимост между биологичните реплики (Фигура S1E). В обобщение, тези данни потвърдиха нашия план за остра и специфична изолация на осъществими PN. Тъй като използваната L7-cre драйверна система индуцира мозаична рекомбинация през първата седмица след раждането (23), започнахме да бракуваме мишки от CTRL и условно (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) събиране на неврони. След завършване на рекомбинацията, тя се нарича Mfn2cKO на 4-седмична възраст. Като крайна точка избрахме 8-седмична възраст, когато PN слоят беше непокътнат, въпреки очевидната митохондриална фрагментация (Фигура 1B и Фигура S1A). Общо определихме количествено общо 3013 протеина, от които около 22% бяха базирани на анотации на MitoCarta 2.0, базирани на митохондриалния протеом като митохондрии (Фигура 1E) (Фигура 1E) (24). Анализът на диференциалната генна експресия, извършен на 8-ма седмица, показа, че само 10,5% от всички протеини са имали значителни промени (Фигура 1F и Фигура S1F), от които 195 протеина са били с понижена регулация, а 120 протеина са били с повишена регулация (Фигура 1F). Струва си да се отбележи, че „иновативният анализ на пътищата“ на този набор от данни показва, че диференциално експресираните гени принадлежат главно към ограничен набор от специфични метаболитни пътища (Фигура 1G). Интересно е, че въпреки че понижената регулация на пътища, свързани с OXPHOS и калциевата сигнализация, потвърждава индуцирането на митохондриална дисфункция в невронни мрежи с дефицит на сливане, други категории, които включват главно метаболизъм на аминокиселините, са значително повишени, което е в съответствие с метаболизма, протичащ в митохондриалните невронни мрежи. Пренавиването е последователно.
(A) Представителни конфокални фотографии на церебеларни срези на CTRL и Mfn2cKO мишки, показващи прогресивна загуба на невронни мрежи (калбиндин, сиво); ядрата са оцветени с DAPI. (B) Количествено определяне на (A) (еднопосочен дисперсионен анализ, ***P<0,001; n = 4 до 6 кръга от три мишки). (C) Експериментален работен процес. (D) Разпределение на топлинната карта на маркери, специфични за Purkinje (горе) и други клетъчни типове (в средата). (E) Диаграма на Вен, показваща броя на митохондриалните протеини, идентифицирани в класифицираната невронна мрежа (PN). (F) Вулканична диаграма на диференциално експресирани протеини в Mfn2cKO неврони на 8 седмици (гранична стойност на значимост 1,3). (G) Анализът на пътя на креативността показва петте най-важни пътя на повишена (червено) и понижена (синьо) регулация в Mfn2cKO PN, класифицирани като 8 седмици. Показано е средното ниво на експресия на всеки открит протеин. Топлинна карта в сивата скала: коригирана P стойност. ns, не е важно.
Данните от протеомиката показват, че протеиновата експресия на комплекси I, III и IV постепенно намалява. Комплекси I, III и IV съдържат есенциални mtDNA-кодирани субединици, докато комплекс II, който е само ядрено-кодиран, е практически незасегнат (Фигура 2A и Фигура S2A). В съответствие с протеомните резултати, имунохистохимията на церебеларни тъканни срези показва, че нивото на MTCO1 (митохондриална цитохром С оксидазна субединица 1) на комплекс IV в PN постепенно намалява (Фигура 2B). mtDNA-кодираната субединица Mtatp8 е значително намалена (Фигура S2A), докато стационарното ниво на ядрено-кодираната АТФ синтазна субединица остава непроменено, което е в съответствие с известния стабилен комплекс F1 на АТФ синтазната подсборка, когато mtDNA експресията е стабилна. Образуването е последователно. Прекъсване (7). Оценката на нивото на mtDNA в сортираните Mfn2cKO PN чрез полимеразна верижна реакция в реално време (qPCR) потвърждава постепенното намаляване на броя на копията на mtDNA. В сравнение с контролната група, на 8-седмична възраст, само около 20% от нивото на mtDNA е запазено (Фигура 2C). В съответствие с тези резултати, оцветяването с конфокална микроскопия на Mfn2cKO PNs е използвано за откриване на ДНК, показвайки зависимата от времето консумация на митохондриални нуклеотиди (Фигура 2D). Установихме, че само някои кандидати, участващи в разграждането на митохондриалните протеини и стрес реакцията, са били повишени, включително Lonp1, Afg3l2 и Clpx, както и фактори за сглобяване на OXPHOS комплекса. Не са открити значителни промени в нивата на протеините, участващи в апоптозата (Фигура S2B). По подобен начин открихме, че каналите на митохондриите и ендоплазмения ретикулум, участващи в транспорта на калций, имат само незначителни промени (Фигура S2C). Освен това, оценката на протеините, свързани с автофагията, не открива значителни промени, което е в съответствие с видимата индукция на автофагозоми, наблюдавана in vivo чрез имунохистохимия и електронна микроскопия (Фигура S3). Въпреки това, прогресивната OXPHOS дисфункция при PNs е съпроводена с очевидни ултраструктурни митохондриални промени. Митохондриални клъстери могат да се видят в клетъчните тела и дендритните дървета на Mfn2cKO PNs на възраст 5 и 8 седмици, а структурата на вътрешната мембрана е претърпяла дълбоки промени (Фигура S4, A и B). В съответствие с тези ултраструктурни промени и значително намаляване на mtDNA, анализът на остри мозъчни церебеларни срезове с тетраметилродамин метилов естер (TMRM) показа, че потенциалът на митохондриалната мембрана в Mfn2cKO PNs е значително намален (Фигура S4C).
(A) Анализ на времевия ход на нивото на експресия на OXPHOS комплекса. Вземете предвид само протеини с P<0,05 на 8 седмици (двуфакторен ANOVA). Пунктирана линия: Без корекция в сравнение с CTRL. (B) Ляво: Пример за церебеларен срез, маркиран с анти-MTCO1 антитяло (скала, 20 μm). Площта, заета от телца на Purkinje клетки, е покрита с жълто. Дясно: Количествено определяне на нивата на MTCO1 (еднопосочен дисперсионен анализ; n = 7 до 20 анализирани клетки от три мишки). (C) qPCR анализ на броя копия на mtDNA в сортираната PN (еднопосочен дисперсионен анализ; n = 3 до 7 мишки). (D) Ляво: Пример за церебеларен срез, маркиран с анти-ДНК антитяло (скала, 20 μm). Площта, заета от телца на Purkinje клетки, е покрита с жълто. Дясно: Количествено определяне на mtDNA лезии (еднопосочен дисперсионен анализ; n = 5 до 9 клетки от три мишки). (E) Пример за остър церебеларен срез, показващ mitoYFP + Пуркиниеви клетки (стрелка) в запис с patch clamp на цели клетки. (F) Количествено определяне на IV крива. (G) Представителни записи на инжектиране на деполяризиращ ток в CTRL и Mfn2cKO Пуркиниеви клетки. Горна следа: Първият импулс, който е задействал AP. Долна следа: Максимална честота на AP. (H) Количествено определяне на постсинаптични спонтанни входове (sPSP). Представителната записваща следа и нейното съотношение на мащабиране са показани в (I). Еднопосочен дисперсионен анализ анализира n = 5 до 20 клетки от три мишки. Данните са изразени като средна стойност±SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Представителни следи от спонтанна AP, записана с помощта на режима на перфорирана patch clamp. Горна следа: Максимална честота на AP. Долна следа: мащабиране на единична AP. (K) Количествено определяне на средната и максималната честота на AP съгласно (J). Тест на Ман-Уитни; n = 5 клетки бяха анализирани от четири мишки. Данните са изразени като средна стойност ± SEM; не е важно.
Очевидни увреждания на OXPHOS бяха открити при 8-седмичните Mfn2cKO PN, което показва, че физиологичната функция на невроните е силно анормална. Следователно, ние анализирахме пасивните електрически характеристики на невроните с дефицит на OXPHOS на 4 до 5 седмици и 7 до 8 седмици, като извършихме записи с patch clamp на цели клетки в остри церебеларни срезове (Фигура 2E). Неочаквано, средният мембранен потенциал в покой и входното съпротивление на Mfn2cKO невроните бяха подобни на контролната група, въпреки че имаше фини разлики между клетките (Таблица 1). По подобен начин, на 4 до 5-седмична възраст, не бяха открити значителни промени в зависимостта ток-напрежение (IV крива) (Фигура 2F). Въпреки това, нито един Mfn2cKO неврон на 7 до 8 седмици не е оцелял след IV режим (стъпка на хиперполяризация), което показва, че има ясна чувствителност към хиперполяризационен потенциал на този късен етап. За разлика от това, при Mfn2cKO невроните, деполяризиращите токове, които причиняват повтарящи се разряди на акционен потенциал (AP), се понасят добре, което показва, че общите им модели на разряд не се различават значително от тези на 8-седмичните контролни неврони (Таблица 1 и Фигура 2G). По подобен начин, честотата и амплитудата на спонтанните постсинаптични токове (sPSCs) са сравними с тези на контролната група, а честотата на събитията се е увеличила от 4 седмици до 5 седмици до 7 седмици до 8 седмици с подобно увеличение (Фигура 2, H и I). Периодът на синаптично съзряване в PNs (25). Подобни резултати са получени след перфорирани PNs пластири. Тази конфигурация предотвратява евентуалната компенсация на клетъчните АТФ дефекти, както може да се случи при запис с клемп за пластири на цели клетки. По-специално, потенциалът на мембраната в покой и честотата на спонтанно задействане на Mfn2cKO невроните не са засегнати (Фигура 2, J и K). В обобщение, тези резултати показват, че невронните мрежи с очевидна OXPHOS дисфункция могат да се справят добре с високочестотните модели на разряд, което показва, че има компенсационен механизъм, който им позволява да поддържат почти нормални електрофизиологични отговори.
Данните са изразени като средна стойност ± SEM (еднофакторен дисперсионен анализ, тест за множествено сравнение на Holm-Sidak; *P<0,05). Номерът на единицата е обозначен в скоби.
Зададохме си за цел да проучим дали някоя категория в набора от протеомни данни (Фигура 1G) включва пътища, които могат да противодействат на тежкия дефицит на OXPHOS, като по този начин обясняваме защо засегнатата периферна артериална хипертония може да поддържа почти нормална електрофизиология (Фигура 2, E до K). Протеомният анализ показа, че ензимите, участващи в катаболизма на аминокиселините с разклонена верига (BCAA), са значително повишени (Фигура 3A и Фигура S5A), а крайният продукт ацетил-CoA (CoA) или сукцинил CoA може да допълни трикарбоксилатите в цикъла на артериосклерозната киселина (TCA). Установихме, че съдържанието на BCAA трансаминаза 1 (BCAT1) и BCAT2 се е увеличило. Те катализират първата стъпка от катаболизма на BCAA чрез генериране на глутамат от α-кетоглутарат (26). Всички субединици, които изграждат комплекса кетокиселина дехидрогеназа с разклонена верига (BCKD), са повишени (комплексът катализира последващото и необратимо декарбоксилиране на получения въглероден скелет на BCAA) (Фигура 3A и Фигура S5A). Въпреки това, не са открити очевидни промени в самите BCAA в сортираните PN, което може да се дължи на повишеното клетъчно усвояване на тези есенциални аминокиселини или на използването на други източници (глюкоза или млечна киселина) за допълване на TCA цикъла (Фигура S5B). PN, на които липсва OXPHOS, също показват повишена активност на разграждане и трансаминиране на глутамин на 8-седмична възраст, което може да се отрази чрез повишена регулация на митохондриалните ензими глутаминаза (GLS) и глутамин пируват трансаминаза 2 (GPT2) (Фигура 3, A и C). Заслужава да се отбележи, че повишената регулация на GLS е ограничена до сплайсираната изоформа глутаминаза C (GLS-GAC) (промяната на Mfn2cKO/CTRL е приблизително 4,5 пъти, P = 0,05) и нейната специфична повишена регулация в раковите тъкани може да поддържа митохондриалната биоенергия. (27)
(A) Топлинната карта показва промяната в нивото на протеина в пъти за посочения път на 8 седмици. (B) Пример за церебеларен срез, маркиран с анти-PCx антитяло (скала, 20 μm). Жълтата стрелка сочи към тялото на Purkinje клетки. (C) Анализ на експресията на протеини във времето, идентифициран като важен кандидат за атеросклероза (множествен t-тест, *FDR <5%; n = 3-5 мишки). (D) По-горе: Схематична диаграма, показваща различните начини за навлизане на маркирания въглерод, съдържащ се в трасера ​​[1-13C]пируват (т.е. чрез PDH или трансартериален път). Долу: Диаграмата на цигулката показва процента на единично маркиран въглерод (M1), превърнат в аспарагинова киселина, лимонена киселина и ябълчена киселина след маркиране на остри церебеларен срези с [1-13C]пируват (сдвоен t-тест; ** P <0,01). (E) Цялостен анализ на времевата история на посочения път. Вземете предвид само протеини с P <0,05 на 8 седмици. Пунктирана линия: няма коригирана стойност (двуфакторен дисперсионен анализ; * P <0,05; *** P <0,001). Данните са изразени като средна стойност ± SEM.
В нашия анализ, катаболизмът на BCAA се е превърнал в един от ключовите пътища за повишаване на регулацията. Този факт категорично подсказва, че обемът на вентилация, влизащ в цикъла на TCA, може да се промени при пациенти с липса на OXPHOS. Това може да представлява основна форма на невронално метаболитно пренастройване, което може да има пряко въздействие върху невронната физиология и оцеляване по време на поддържането на тежка OXPHOS дисфункция. В съответствие с тази хипотеза, открихме, че основният антиатеросклеротичен ензим PCx е повишен (Mfn2cKO/CTRL се променя приблизително 1,5 пъти; Фигура 3А), което катализира превръщането на пируват в оксалоацетат (28), за който се смята, че се намира в мозъчната тъкан. Експресията е ограничена до астроцити (29, 30). В съответствие с резултатите от протеомиката, конфокалната микроскопия показа, че експресията на PCx е специфично и значително повишена при пациенти с дефицит на OXPHOS, докато реактивността на PCx е ограничена главно до съседните глиални клетки на Бергман от контролната група (Фигура 3B). За да тестваме функционално наблюдаваното повишено регулиране на PCx, третирахме остри церебеларни срезове с [1-13C]пируват трасер. Когато пируватът беше окислен от пируват дехидрогеназа (PDH), неговият изотопен маркер изчезна, но се включи в междинните продукти на TCA цикъла, когато пируватът се метаболизира чрез съдови реакции (Фигура 3D). В подкрепа на нашите протеомни данни, наблюдавахме голям брой маркери от този трасер в аспарагиновата киселина на срезове Mfn2cKO, докато лимонената киселина и ябълчената киселина също показаха умерена тенденция, макар и не значителна (Фигура 3D).
В допаминовите неврони на мишки MitoPark с митохондриална дисфункция, причинена от допаминови неврони, специфично разрушаващи гена на митохондриалния транскрипционен фактор А (Tfam) (Фигура S6B), експресията на PCx също е значително повишена (31), което показва, че ацетонова киселинна артериосклероза. Проявата на заболяването се регулира по време на дисфункцията на невронния OXPHOS в тялото. Струва си да се отбележи, че е установено, че уникални ензими (32-34), които могат да се експресират в неврони, които могат да бъдат свързани с артериосклероза, са значително повишени в PNs, лишени от OXPHOS, като пропионил-CoA карбоксилаза (PCC-A), малонил-CoA превръща пропионил-CoA в сукцинил-CoA и митохондриален ябълчен ензим 3 (ME3), чиято основна роля е да възстановява пируват от малат (Фигура 3, A и C) (33, 35). Освен това, открихме значително увеличение на ензима Pdk3, който фосфорилира и по този начин инактивира PDH (36), докато не бяха открити промени в ензима Pdp1, който активира PDH, или в самия ензимен комплекс PDH (Фигура 3А). Съответно, в Mern2cKO PNs, фосфорилирането на α1 субединицата α (PDHE1α) субединицата на пируват дехидрогеназния компонент E1 на PDH комплекса в Ser293 (известен с това, че инхибира ензимната активност на PDH) беше засилено (Фигура S6C) (Фигура S6C). Пируватът няма съдов достъп.
Накрая, открихме, че суперпътят на биосинтеза на серин и глицин, свързаният с него митохондриален фолатен (1C) цикъл и биосинтеза на пролин (Фигура 1G и Фигура S5C) са значително повишени, според докладите, по време на процеса на активиране. Околните тъкани се активират с митохондриална дисфункция (5-7). Конфокален анализ, подкрепящ тези протеомни данни, показа, че при PN с липсващ OXPHOS, церебеларните срезове на 8-седмични мишки са били подложени на серин хидроксиметилтрансфераза 2 (SHMT2), ключов ензим на митохондриалния фолатен цикъл. Значителен имунен отговор (Фигура S5D). В 13 остри церебеларни срезове, инкубирани с CU-глюкоза, експериментите за метаболитно проследяване допълнително потвърдиха повишената регулация на биосинтеза на серин и пролин, което показва, че потокът от въглеродни изоформи в серин и пролин се е увеличил (Фигура S5E). Тъй като реакциите, промотирани от GLS и GPT2, са отговорни за синтеза на глутамат от глутамин и трансаминирането между глутамат и α-кетоглутарат, тяхната повишена регулация показва, че невроните с дефицит на OXPHOS имат повишено търсене на глутамат. Това може да е насочено към поддържане на повишената биосинтеза на пролин (Фигура S5C). За разлика от тези промени, протеомен анализ на церебеларни астроцити от PN-специфични Mfn2cKO мишки показа, че тези пътища (включително всички антипероксидази) не се променят значително в експресията, като по този начин демонстрират, че това метаболитно пренасочване е селективно към разградената PN (Фиг. S6, D до G).
В обобщение, тези анализи разкриха значително различни модели на темпорално активиране на специфични метаболитни пътища при невронни неврони. Въпреки че анормалната невронна митохондриална функция може да доведе до ранна атеросклероза и 1C ремоделиране (Фигура 3E и Фигура S5C) и дори до предвидими промени в експресията на I и IV комплекси, промените в de novo синтеза на серин са едва в късните етапи. OXPHOS дисфункция (Фигура 3E и Фигура S5C). Тези открития определят последователен процес, при който индуцираните от стреса митохондриални (1C цикъл) и цитоплазмени (биосинтез на серин) клетки реагират синергично с увеличаването на атеросклерозата в TCA цикъла, за да променят невроналния метаболизъм.
8-седмични OXPHOS-дефицитни PN могат да поддържат високочестотна възбуждаща активност и да претърпят значително метаболитно повторно свързване, за да компенсират митохондриалната дисфункция. Това откритие повдига интересна възможност, че дори в този момент тези клетки могат също да получат терапевтична интервенция за забавяне или предотвратяване на невродегенерация. Късно. Решихме тази възможност чрез две независими интервенции. При първия метод проектирахме Cre-зависим аденоасоцииран вирус (AAV) вектор, така че MFN2 да може да бъде селективно експресиран в OXPHOS-дефицитни PN in vivo (Фигура S7A). AAV, кодиращ MFN2, и флуоресцентният репортерен ген mCherry (Mfn2-AAV) бяха проверени в първични невронни култури in vitro, което доведе до експресия на MFN2 по Cre-зависим начин и възстанови митохондриалната морфология, като по този начин предотврати невромутацията в Mfn2cKO неврони (Фигура S7, B, D и E). След това проведохме in vivo експерименти за стереотактично доставяне на 8-седмични Mfn2-AAV в церебеларната кора на Mfn2cKO и контролни мишки и анализирахме 12-седмични мишки (Фигура 4A). Третираните Mfn2cKO мишки умряха (Фигура 1, A и B) (16). Вирусната трансдукция in vivo доведе до селективна експресия на PN в някои церебеларни кръгове (Фигура S7, G и H). Инжектирането на контролния AAV, експресиращ само mCherry (Ctrl-AAV), нямаше значителен ефект върху степента на невродегенерация при Mfn2cKO животни. За разлика от това, анализът на Mfn2cKO, трансдуцирани с Mfn2-AAV, показа значителен защитен ефект на клетъчния слой на PN (Фигура 4, B и C). По-специално, плътността на невроните изглежда почти неразличима от контролните животни (Фигура 4, B и C и Фигура S7, H и I). Експресията на MFN1, но не и на MFN2, е еднакво ефективна за предотвратяване на невронна смърт (Фигура 4C и Фигура S7, C и F), което показва, че експресията на ектопичен MFN1 може ефективно да компенсира липсата на MFN2. По-нататъшен анализ на ниво единична PN показа, че Mfn2-AAV до голяма степен е възстановил ултраструктурата на митохондриите, нормализирал е нивата на mtDNA и е обърнал високата експресия на антиангиогенезния маркер PCx ​​(Фигура 4, C до E). Визуалната проверка на спасените Mfn2cKO мишки в състояние на покой показа, че тяхната стойка и двигателни симптоми (движение S1 до S3) са подобрени. В заключение, тези експерименти показват, че забавеното повторно въвеждане на MFN2 в PN със силен дефицит на OXPHOS е достатъчно, за да обърне консумацията на mtDNA и да индуцира атеросклероза, като по този начин предотвратява дегенерацията на аксоните и невронната смърт in vivo.
(A) Схема, показваща експерименталния график за инжектиране на AAV, кодиращ MFN2, когато посоченият метаболитен път е активиран. (B) Представителни конфокални изображения на 12-седмични церебеларни срезове, трансдуцирани на 8 седмици в Mfn2cKO мишки и маркирани с анти-калбиндин антитяло. Дясно: Мащабиране на аксонови влакна. Мащабът на аксоновото увеличение е 450 и 75 μm. (C) Ляво: Количествено определяне на плътността на Purkinje клетките в AAV трансдукционната бримка (AAV+) (еднопосочен дисперсионен анализ; n = 3 мишки). Дясно: mtDNA фокусен анализ в трансдуцирана PN на 12-та седмица (несдвоен t-тест; n = 6 клетки от три мишки). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Представителни трансмисионни електронни микрографии на PN на Mfn2cKO церебеларни срезове, трансдуцирани с посочените вирусни вектори. Розовата маска илюстрира площта, заета от дендрити, а жълтият пунктиран квадрат илюстрира увеличението, предоставено вдясно; n представлява ядрото. Мащабна лента, 1μm. (E) показва пример за PCx оцветяване в PN трансдуцирана на 12 седмици. Мащабна лента, 20μm. OE, свръхекспресия; FC, промяна в пъти.
Накрая, изследвахме значението на индуцираното от пероксидаза клетъчно оцеляване при периферни неврони (ПН), които са претърпели OXPHOS дисфункция. Генерирахме mCherry, кодиращ AAV-shRNA (РНК с къса фиба), специфично насочена към миша PCx mRNA (AAV-shPCx), и инжектирахме вируса или неговия разбъркан контролен ген (AAV-scr) в малкия мозък на Mfn2cKO мишки. Инжектирането беше извършено на четвъртата седмица от възрастта (Фигура 5А), за да се постигне ефективно потискане на PCx по време на периода, когато експресията на PCx се е увеличила (Фигура 3C) и слоят от ПН клетки е бил все още непокътнат (Фигура 1А). Струва си да се отбележи, че потискането на PCx (Фигура S8A) води до значително ускоряване на смъртта на ПН, която е ограничена до заразения пръстен (Фигура 5, B и C). За да разберем механизма на метаболитните ефекти, индуцирани от повишената регулация на PCx, изследвахме редокс статуса на периферните неврони (ПН) след едновременното им понижаване на PCx и едновременното експресиране на AAV-медиирания оптичен биосензор Grx1-roGFP2 (Фигура S8, B до D), за да оценим относителната промяна в редокс потенциала на пептида (38). След това проведохме двуфотонна флуоресцентна доживотна образна микроскопия (FLIM) в остри мозъчни срезове на 7-седмични Mfn2cKO или контролни котила, за да открием потенциални промени в цитоплазмения редокс статус след проверка на FLIM условията (Фигура S8, E до G). Анализът показа значително повишаване на окислителното състояние на единични Mfn2cKO ПН, лишени от PCx експресия, което е различно от контролните неврони или Mfn2cKO ПН, експресиращи само разбъркана shRNA (Фигура 5, D и E). Когато експресията на PCx беше понижена, процентът на Mfn2cKO PNs, показващи силно окислено състояние, се увеличи повече от три пъти (Фигура 5E), което показва, че повишената регулация на PCx поддържа редокс капацитета на дегенерираните неврони.
(A) Схема, показваща експерименталния график за инжектиране на AAV, кодиращ shPCx, когато посоченият метаболитен път е активиран. (B) Представителни конфокални снимки на 8-седмични церебеларни срези в Mfn2cKO мишки, трансдуцирани и маркирани с антикалциневриново антитяло на 4 седмици. Скала, 450μm. (C) Количествено определяне на плътността на Purkinje клетки в AAV-трансдуцирани бримки (еднопосочен дисперсионен анализ; n = 3 до 4 мишки). Данните са изразени като средна стойност±SEM; ***P<0,001. (D) Представителна FLIM картина показва средната продължителност на живота на 7-седмични PN, експресиращи глутатионов редокс сензор Grx1-roGFP2 при определените експериментални условия. LUT (look-up table) съотношение: интервал на оцеляване (в пикосекунди). Скала, 25μm. (E) Хистограмата показва разпределението на стойностите на продължителността на живота на Grx1-roGFP2 от (D) (n=158 до 368 клетки в две мишки при всяко условие). Кръговата диаграма над всяка хистограма: показва броя на клетките със значително по-дълги (червени, окислени) или по-къси (сини, намалени) стойности на продължителността на живота, които надвишават 1 стандартно отклонение от средната стойност на продължителността на живота в CTRL-AAV-scr. (F) Предложеният модел показва защитния ефект на повишената регулация на невронния PCx.
Като цяло, данните, които предоставяме тук, показват, че повторната експресия на MFN2 може напълно да спаси напреднал периферен нерв (ПН) с тежък OXPHOS дефицит, тежко изчерпване на mtDNA и изключително анормална ista-подобна морфология, като по този начин осигурява непрекъснат напредък дори при напреднали заболявания. Невродегенерацията предоставя обратими доказателства за стадия преди клетъчната смърт. Тази степен на метаболитна гъвкавост се подчертава допълнително от способността на невроните да индуцират атеросклероза (пренастройване на TCA цикъла), което инхибира експресията на PCx в ПН, лишени от OXPHOS, и засилва клетъчната смърт, като по този начин играе защитна роля (Фигура 5F).
В това проучване предоставихме доказателства, че реакцията на невроните (ПН) към дисфункция на OXPHOS е постепенно да се сближат с атеросклероза на TCA цикъла чрез диференциалния път на активиране, активиран от метаболитни програми. Потвърдихме протеомния анализ с много допълнителни методи и разкрихме, че когато са предизвикани от тежка митохондриална дисфункция, невроните имат непозната досега форма на метаболитна еластичност. За наша изненада, целият процес на пренастройване не маркира непременно терминалното метаболитно състояние, което съпътства невродегенерацията постепенно и необратимо, но нашите данни показват, че той може да представлява поддържащ неврон дори на етапа преди клетъчната смърт. Функционален компенсационен механизъм. Това откритие показва, че невроните имат значителна степен на метаболитна пластичност в тялото. Този факт доказва, че по-късното повторно въвеждане на MFN2 може да обърне експресията на ключови метаболитни маркери и да предотврати ПН дегенерация. Напротив, той инхибира атеросклерозата и ускорява нервите. транссексуален.
Едно от най-вълнуващите открития в нашето изследване е, че периферните неврони, на които липсва OXPHOS, могат да променят метаболизма на TCA цикъла чрез повишаване на ензимите, които специфично стимулират артериосклерозата. Метаболитното пренареждане е често срещана характеристика на раковите клетки, някои от които разчитат на глутамин, за да допълнят междинните продукти на TCA цикъла, за да произведат редуциращи еквиваленти, които задвижват дихателната верига и поддържат производството на прекурсори на липидна и нуклеотидна биосинтеза (39, 40). Неотдавнашно проучване показа, че в периферните тъкани, изпитващи OXPHOS дисфункция, повторното свързване на метаболизма на глутамин/глутамат също е важна характеристика (5, 41), където посоката на навлизане на глутамин в TCA цикъла зависи от тежестта на OXPHOS увреждането (41). Въпреки това, липсват ясни доказателства за каквото и да е сходство на невронната метаболитна пластичност в организма и нейното възможно значение в контекста на заболяването. В неотдавнашно in vitro проучване беше показано, че първичните кортикални неврони мобилизират глутаматните запаси за невротрансмисия, като по този начин насърчават оксидативния метаболизъм и атеросклерозата при условия на метаболитен стрес (42). Заслужава да се отбележи, че под фармакологичното инхибиране на ензима сукцинат дехидрогеназа от TCA цикъла, се смята, че карбоксилирането на пируват поддържа синтеза на оксалоацетат в култивирани церебеларни гранулирани неврони (34). Въпреки това, физиологичното значение на тези механизми за мозъчната тъкан (където се смята, че атеросклерозата е ограничена главно до астроцити) все още има важно физиологично значение (43). В този случай, нашите данни показват, че периферните нерви (ПН), увредени от OXPHOS в тялото, могат да бъдат превключени към разграждане на BCAA и карбоксилиране на пируват, които са двата основни източника на добавяне на междинни продукти от TCA пула. Въпреки че е предложен предполагаемият принос на катаболизма на BCAA към невроналния енергиен метаболизъм, в допълнение към ролята на глутамата и GABA за невротрансмисията (44), все още няма доказателства за тези механизми in vivo. Следователно е лесно да се предположи, че дисфункционалните ПН могат автоматично да компенсират консумацията на междинни продукти на TCA, задвижвана от процеса на асимилация, чрез увеличаване на атеросклерозата. По-специално, повишената регулация на PCx може да е необходима, за да се поддържа повишено търсене на аспарагинова киселина, което се предполага при пролифериращи клетки с митохондриална дисфункция (45). Нашият метаболомичен анализ обаче не разкри значителни промени в стационарното ниво на аспарагинова киселина в Mfn2cKO PNs (Фигура S6A), което вероятно отразява различното метаболитно използване на аспарагинова киселина между пролифериращите клетки и постмитотичните неврони. Въпреки че точният механизъм на повишена регулация на PCx в дисфункционални неврони in vivo все още не е характеризиран, ние демонстрирахме, че този преждевременен отговор играе важна роля за поддържане на редокс състоянието на невроните, което беше демонстрирано в FLIM експерименти върху церебеларни срезове. По-специално, предотвратяването на повишената регулация на PCx от PNs може да доведе до по-окислено състояние и да ускори клетъчната смърт. Активирането на разграждането на BCAA и карбоксилирането на пируват не са начини за характеризиране на периферните тъкани на митохондриалната дисфункция (7). Следователно, те изглеждат приоритетна характеристика на невроните с дефицит на OXPHOS, дори и да не е единствената характеристика, която е важна за невродегенерацията. .
Церебеларната болест е хетерогенен тип невродегенеративно заболяване, което обикновено се проявява като атаксия и често уврежда периферните нерви (ПН) (46). Тази невронна популация е особено уязвима към митохондриална дисфункция, тъй като тяхната селективна дегенерация при мишки е достатъчна, за да възпроизведе много от двигателните симптоми, които характеризират човешката спиноцеребеларна атаксия (16, 47, 48). Според доклади, трансгенен миши модел с мутантен ген е свързан с човешка спиноцеребеларна атаксия и има митохондриална дисфункция (49, 50), което подчертава важността на изучаването на последиците от дефицита на OXPHOS при ПНПХ. Следователно е особено подходящо ефективно да се изолира и изследва тази уникална невронна популация. Въпреки това, като се има предвид, че ПН са много чувствителни към налягане и представляват нисък дял от цялата популация на малките клетки, за много изследвания, базирани на омика, селективното им разделяне като цели клетки все още е предизвикателство. Въпреки че е почти невъзможно да се постигне абсолютна липса на замърсяване на други клетъчни типове (особено тъкани на възрастни), ние комбинирахме ефективна стъпка на дисоциация с FACS, за да получим достатъчен брой жизнеспособни неврони за последващ протеомичен анализ и да постигнем доста високо протеиново покритие (около 3000 протеина) в сравнение със съществуващия набор от данни за целия малък мозък (51). Чрез запазване на жизнеспособността на цели клетки, методът, който предоставяме тук, ни позволява не само да проверим промените в метаболитните пътища в митохондриите, но и да проверим промените в техните цитоплазмени аналози, което допълва използването на митохондриални мембранни маркери за обогатяване на клетъчния тип. Новият метод за броя на митохондриите в сложни тъкани (52, 53). Методът, който описваме, не е свързан само с изучаването на клетките на Пуркиние, но може лесно да се приложи към всеки тип клетка за справяне с метаболитните промени в болни мозъци, включително други модели на митохондриална дисфункция.
Накрая, ние идентифицирахме терапевтичен прозорец по време на този процес на метаболитно пренареждане, който може напълно да обърне ключовите признаци на клетъчен стрес и да предотврати невронна дегенерация. Следователно, разбирането на функционалните последици от описаното тук пренареждане може да предостави фундаментални прозрения за възможни лечения за поддържане на невронната жизнеспособност по време на митохондриална дисфункция. Необходими са бъдещи изследвания, насочени към анализиране на промените в енергийния метаболизъм в други типове мозъчни клетки, за да се разкрие напълно приложимостта на този принцип към други неврологични заболявания.
Мишки MitoPark са описани по-рано (31). Мишки C57BL/6N с loxP фланкиращи Mfn2 гени са описани по-рано (18) и са кръстосани с L7-Cre мишки (23). Полученото двойно хетерозиготно потомство след това е кръстосано с хомозиготни Mfn2loxP/Mfn2loxP мишки, за да се генерират Purkinje-специфични генни нокаути за Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). В подгрупа от чифтосване, алелът Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) е въведен чрез допълнителни кръстосвания (20). Всички процедури с животни са извършени в съответствие с европейските, националните и институционалните насоки и са одобрени от LandesamtfürNatur of Umwelt и Verbraucherschutz, Северен Рейн-Вестфалия, Германия. Работата с животни също следва насоките на Европейската федерация на асоциациите за лабораторни животни.
След анестезиране на цервикалната дислокация на бременната жена, ембрионът на мишката е изолиран (E13). Кората е дисектирана в балансиран солен разтвор на Hanks (HBSS), допълнен с 10 mM Hepes, и е прекарана през Dulbecco's Modified Eagle's Medium, съдържаща папаин (20 U/ml) и цистеин (1μg/ml). Тъканта се инкубира в DMEM (среда за култури) и се дисоциира чрез ензимно разграждане (Ml) при 37°C в продължение на 20 минути, след което се смила механично в DMEM (среда за култури), допълнена с 10% фетален говежди серум. Клетките са посяти върху покривни стъкла, покрити с полилизин, при плътност 2×106 на 6 cm културална паничка или при плътност 0,5×105 клетки/cm2 за образен анализ. След 4 часа средата е заменена с Neurobasal безсерумна среда, съдържаща 1% добавка B27 и 0,5 mM GlutaMax. След това невроните бяха поддържани при 37°C и 5% CO2 през целия експеримент и хранени веднъж седмично. За да се индуцира рекомбинация in vitro, 3 μl (24-ямкова културална плака) или 0,5 μl (24-ямкова плака) от следния AAV9 вирусен вектор беше използван за третиране на невроните на втория ден in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, каталожен номер 105530-AAV9) и AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, каталожен номер 105545-AAV9).
Мишата Mfn1 и Mfn2 комплементарна ДНК (получена съответно от Addgene плазмид #23212 и #23213) е маркирана с V5 последователността (GKPIPNPLLGLDST) в C-края и е слята с mCherry в рамка чрез T2A последователността. Grx1-roGFP2 е подарък от Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Чрез заместване на tdTomato касетата с помощта на конвенционални методи за клониране, касетата е субклонирана в pAAV-CAG-FLEX-tdTomato гръбнака (Addgene референтен номер 28306), за да се генерират pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 и pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 вектори. Подобна стратегия беше използвана за генериране на контролния вектор pAAV-CAG-FLEX-mCherry. За да се генерира AAV-shPCx конструкцията, е необходим плазмиден AAV вектор (VectorBuilder, pAAV [shRNA]-CMV-mCherry-U6-mPcx-[shRNA#1]), който съдържа ДНК последователността, кодираща shRNA, насочена към миши PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Под контрола на U6 промотора, mCherry се използва под контрола на CMV промотора. Производството на помощни AAV вектори беше извършено съгласно инструкциите на производителя (Cell Biolabs). Накратко, използвайте трансферен плазмид, носещ временно кодиращия ген mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) на 293AAV клетки - T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) или Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), както и кодиращ капсиден протеин AAV1 и спомагателен протеин. Опаковъчен плазмид, използвайки калциево-фосфатен метод. Суровият вирусен супернатант е получен чрез цикли на замразяване-размразяване в баня от сух лед/етанол и клетките са лизиран във фосфатно-буферен физиологичен разтвор (PBS). Векторът AAV беше пречистен чрез прекъснато ултрацентрофугиране с йодиксанолов градиент (24 часа при 32 000 rpm и 4°C) и концентриран с помощта на центробежен филтър Amicon ultra-15. Геномният титър на AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 копие на генома (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX беше както е описано по-рано (54), измерен чрез количествена PCR в реално време (qPCR)-MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) и AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Първичните неврони бяха остъргани в леденостуден 1x PBS, пелетизирани и след това хомогенизирани в 0.5% Triton X-100 / 0.5% натриев деоксихолат/PBS лизисен буфер, съдържащ фосфатаза и протеазен инхибитор (Roche). Количественото определяне на протеините беше извършено с помощта на бицинхонинова киселина (Thermo Fisher Scientific). След това протеините бяха разделени чрез SDS-полиакриламидна гел електрофореза и след това блотирани върху поливинилиден флуоридна мембрана (GE Healthcare). Блокирайте неспецифичните места и инкубирайте с първичното антитяло (вижте Таблица S1 за подробности) в 5% мляко в TBST (Tris-буфериран физиологичен разтвор с Tween), стъпките на промиване и вторичното антитяло в TBST инкубирайте. Инкубирайте с първичното антитяло за една нощ при +4°C. След промиване, нанесете вторичното антитяло за 2 часа при стайна температура. Впоследствие, чрез инкубиране на същото блот с анти-β-актиново антитяло, беше потвърдено същото зареждане. Откриване чрез преобразуване в хемилуминесценция и усилване на хемилуминесценцията (GE Healthcare).
Невроните, предварително посяти върху покривни стъкла, бяха фиксирани с 4% параформалдехид (PFA)/PBS в определения времеви момент при стайна температура в продължение на 10 минути. Покривните стъкла първо се промиват с 0,1% Triton X-100/PBS в продължение на 5 минути при стайна температура, а след това в блокиращ буфер [3% говежди серумен албумин (BSA)/PBS]. На втория ден покривните стъкла бяха промити с блокиращ буфер и инкубирани със съответното флуорофор-конюгирано вторично антитяло в продължение на 2 часа при стайна температура; накрая, пробите бяха промити обилно в PBS с 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), оцветени контра-оцветено и след това фиксирани върху предметното стъкло на микроскопа с Aqua-Poly/Mount.
Мишките (мъжки и женски) бяха анестезирани чрез интраперитонеално инжектиране на кетамин (130 mg/kg) и ксилазин (10 mg/kg) и подкожно приложен аналгетик карпрофен (5 mg/kg). След това бяха поставени в стереотактичен инструмент (Kopf), снабден с топла подложка. Черепът беше открит и с помощта на зъботехническа бормашина се изтъни частта от церебеларната кора, съответстваща на мис костта (от ламбда: опашка 1.8, странично 1, съответстващо на лобули IV и V). С извита игла за спринцовка внимателно се създаде малък отвор в черепа, за да се избегне нарушаване на васкулатурата отдолу. След това тънката стъклена капилярка бавно се вкарва в микроотвора (от -1.3 до -1 от вентралната страна на твърдата мозъчна обвивка) и 200 до 300 nl AAV се инжектират в микроинжектора (Narishige) с ръчни спринцовки (Narishige) няколко пъти при ниско налягане в продължение на 10 до 20 минути. След инфузията, капилярката се поставя за още 10 минути, за да се позволи на вируса да се разпространи напълно. След като капилярите бъдат извадени, кожата се зашива внимателно, за да се сведе до минимум възпалението на раната и да се даде възможност на животното да се възстанови. Животните са лекувани с аналгетици (каспофен) в продължение на няколко дни след операцията, през което време физическото им състояние е внимателно наблюдавано и след това са евтаназирани в посочения момент. Всички процедури са проведени в съответствие с европейските, националните и институционалните насоки и са одобрени от LandesamtfürNatur of Umwelt und Verbraucherschutz, Северен Рейн-Вестфалия, Германия.
Животните бяха анестезирани с кетамин (100 mg/kg) и ксилазин (10 mg/kg), а сърцето беше перфузирано първо с 0.1 M PBS, а след това с 4% PFA в PBS. Тъканта беше дисектирана и фиксирана в 4% PFA/PBS за една нощ при 4°C. Вибриращ нож (Leica Microsystems GmbH, Виена, Австрия) беше използван за приготвяне на сагитални срези (с дебелина 50 μm) от фиксирания мозък в PBS. Освен ако не е посочено друго, оцветяването на свободно плаващи срези беше извършено както е описано по-горе (13) при стайна температура и разбъркване. Накратко, първо, получените срези бяха пермеабилизирани с 0.5% Triton X-100/PBS за 15 минути при стайна температура; за някои епитопи (Pcx и Shmt2), чрез нагряване на срезите за 25 минути в tris-EDTA буфер при 80°C (pH 9) вместо тази стъпка. След това срезите бяха инкубирани с първично антитяло (виж Таблица S1) в блокиращ буфер (3% BSA/PBS) при 4°C за една нощ с разбъркване. На следващия ден срезите бяха промити с блокиращ буфер и инкубирани с подходящото флуорофор-конюгирано вторично антитяло за 2 часа при стайна температура; накрая, срезите бяха промити обилно в PBS, оцветени с DAPI и след това фиксирани с AquaPolymount върху предметно стъкло на микроскоп.
За изобразяване на пробата е използван лазерен сканиращ конфокален микроскоп (TCS SP8-X или TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems), оборудван с лазер с бяла светлина и 405 диоден ултравиолетов лазер. Чрез възбуждане на флуорофора и събиране на сигнала с хибриден детектор (HyDs), софтуерът LAS-X е използван за събиране на подредени изображения, съответстващи на семплирането на Найкуист в последователен режим: за неколичествени панели, това са силно динамични сигнали (например, в соматични клетки и дендрити) (mtYFP). Използвайте HyD за откриване на броя на PN в режим BrightR. Прилага се стробиране от 0,3 до 6 ns за намаляване на фона.
Образуване в реално време на сортирани клетки. След сортиране в Neurobasal-A среда, съдържаща 1% добавка B27 и 0.5 mM GlutaMax, клетките бяха незабавно посяти върху покрити с поли-1-лизин стъклени слайдове (μ-Slide8 Well, Ibidi, каталожен номер 80826) и след това държани при 37°C и 5% CO2 за 1 час, за да се позволи на клетките да се утаят. Образуването в реално време беше извършено на лазерен сканиращ конфокален микроскоп Leica SP8, оборудван с бял лазер, HyD, маслен обектив с 63×[1.4 числена апертура (NA)] и нагревателна платформа.
Мишката беше бързо анестезирана с въглероден диоксид и обезглавена, мозъкът беше бързо изваден от черепа и нарязан на сагитални срези с дебелина 200 μm (за експеримент с 13C маркиране) или дебелина 275 μm (за експерименти с два фотона), запълнени със следните материали. Сладоледът (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Германия) е запълнен със следните вещества: 125 mM леденостуден, наситен с въглерод (95% O2 и 5% CO2) нискокалориен + изкуствен цереброспинален флуид (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM натриево-фосфатен буфер, 25 mM NaHCO3, 25 mM глюкоза, 0.5 mM CaCl2 и 3.5 mM MgCl2 (осмотично налягане от 310 до 330 mmol). Прехвърлете получените мозъчни срезове в предварителна инкубационна камера, съдържаща среда с по-високо съдържание на Ca2+ ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM натриев фосфатен буфер, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-глюкоза, 1.0 mM CaCl2 и 2.0 mM MgCl2) с pH 7.4 и от 310 до 320 mmol).
По време на процеса на изобразяване, срезовете бяха преместени в специално предназначена за изобразяване стая и експериментът беше проведен при непрекъсната перфузия с ACSF при постоянна температура от 32° до 33°C. За изобразяване на срезовете беше използван многофотонен лазерен сканиращ микроскоп (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems), оборудван с обектив Leica 25x (NA 0.95, вода) и Ti:сапфирен лазер (Chameleon Vision II, Coherent). FLIM модул (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM на Grx1-roGFP2. Промените в цитоплазменото редокс състояние на периферните клетки (ПН) бяха измерени чрез двуфотонна FLIM в сагитални мозъчни срезове, където биосензорът Grx1-roGFP2 е насочил ПН към тях. В ПН слоя, полето за събиране е избрано на около 50 до 80 μm под повърхността на среза, за да се гарантира наличието на жизнеспособна ПН (т.е. липсата на структура с мъниста или невронни морфологични промени по дендритите) и двойно положителния roGFP2 сензор и AAV, кодиращи shRNA PCx или нейната контролна последователност (всеки от които коекспресира mCherry). Събират се единични изображения с 2x цифрово увеличение [дължина на вълната на възбуждане: 890 nm; 512 nm 512 пиксела]. Детекция: вътрешен HyD, филтърна група флуоресцеин изотиоцианат (FITC)] и се използва осредняване на изображението в рамките на 2 до 3 минути, за да се гарантира, че са събрани достатъчно фотони (общо 1000 фотона) за напасване на кривата. Чувствителността на Grx1-roGFP2 сондата и проверката на FLIM условията бяха извършени чрез наблюдение на стойността на продължителността на живота на roGFP2 при добавяне на екзогенни 10 mM H2O2 към перфузионния ACSF (за максимизиране на окислението, което води до увеличаване на продължителността на живота) и след това добавяне на 2 mM дитиотреитол (минимизира степента на редукция, което води до намаляване на продължителността на живота) (Фигура S8, D до G). Използвайте софтуера FLIMfit 5.1.1, за да анализирате получените резултати, напаснете единичната експоненциална крива на затихване на цялото изображение към измерената IRF (функция на отговор на инструмента), като χ2 е приблизително 1. За да се изчисли времето на живот на единична PN, маската около нервното тяло беше начертана ръчно и средната продължителност на живота във всяка маска беше използвана за количествено определяне.
Анализ на митохондриалния потенциал. След инкубиране на острата секция със 100 nM TMRM, директно добавен към перфузирания ACSF в продължение на 30 минути, промените в митохондриалния потенциал на PNs бяха измерени с двуфотонен микроскоп. TMRM изобразяването беше извършено чрез възбуждане на сондата при 920 nm и използване на вътрешен HyD (тетраметилродамин изотиоцианат: 585/40 nm) за събиране на сигнали; чрез използване на същата дължина на вълната на възбуждане, но с използване на различен вътрешен HyD (FITC: 525/50) за изобразяване на mtYFP. Използвайте плъгина Image Calculator на ImageJ, за да оцените митохондриалния потенциал на ниво единична клетка. Накратко, уравнението на плъгина: signal = min (mtYFP, TMRM) се използва за идентифициране на митохондриалната област, която показва TMRM сигнала в Purkinje Somali в еднослойното конфокално изображение на съответния канал. След това площта на пикселите в получената маска се определя количествено и след това се нормализира върху съответното прагово еднослойно изображение на mtYFP канала, за да се получи митохондриалната фракция, показваща митохондриалния потенциал.
Изображението е деконволюирано със софтуера Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). За сканираните изображения на плочки, монтажът на една плочка е направен с помощта на алгоритъма за автоматично сшиване, предоставен от софтуера LAS-X. След калибриране на изображението, използвайте ImageJ и Adobe Photoshop за допълнителна обработка на изображението и равномерно регулиране на яркостта и контраста. Използвайте Adobe Illustrator за графична подготовка.
Анализ на фокуса на mtDNA. Броят на mtDNA лезиите беше количествено определен върху церебеларни срези, маркирани с антитела срещу ДНК, чрез конфокален микроскоп. Всяка целева област беше създадена за клетъчното тяло и ядрото на всяка клетка, а съответната площ беше изчислена с помощта на плъгина Multi Measure (софтуер ImageJ). Извадете ядрената площ от площта на клетъчното тяло, за да получите цитоплазмената площ. Накрая, плъгинът Analyze Particles (софтуер ImageJ) беше използван за автоматично количествено определяне на цитоплазмените ДНК точки, показващи mtDNA върху праговото изображение, и получените резултати бяха нормализирани спрямо средната PN стойност на CTRL мишки. Резултатите са изразени като среден брой нуклеозиди на клетка.
Анализ на протеиновата експресия. Използвайте плъгина Image Calculator на ImageJ, за да оцените протеиновата експресия в PN на ниво единична клетка. Накратко, в еднослойното конфокално изображение на съответния канал, чрез уравнението: signal = min (mtYFP, антитяло), се идентифицира митохондриалната област, която показва имунореактивност към определено антитяло в Purkina. След това площта на пиксела в получената маска се определя количествено и след това се нормализира спрямо съответното прагово еднослойно изображение на mtYFP канала, за да се получи митохондриалната фракция на показания протеин.
Анализ на плътността на Пуркиниевите клетки. Плъгинът Cell Counter на ImageJ беше използван за оценка на плътността на Пуркиние чрез разделяне на броя на преброените Пуркиниеви клетки на дължината на церебеларния пръстен, зает от преброените клетки.
Подготовка и събиране на проби. Мозъците от контролната група и Mfn2cKO мишки бяха фиксирани в 2% PFA/2.5% глутаралдехид в 0.1 M фосфатен буфер (PB), след което бяха приготвени коронални срези с помощта на ресничести (Leica Mikrosysteme GmbH, Виена, Австрия) (дебелина от 50 до 60 μm). След това бяха фиксирани в PB буфер в 1% тетраоксид и 1.5% калиев фероцианид при стайна температура в продължение на 1 час. Срезите бяха промити три пъти с дестилирана вода и след това оцветени със 70% етанол, съдържащ 1% уранил ацетат в продължение на 20 минути. След това срезите бяха дехидратирани в градуиран алкохол и вградени в епоксидна смола Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, каталожен номер 14040) между покрити със силиций стъклени слайдове и накрая при 60°C полимеризирани в пещ за 48 часа. Беше избрана област от церебеларната кора и бяха изрязани ултратънки срези с дебелина 50 nm на Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Виена, Австрия) и взети върху медна решетка с прорези 2×1 mm, покрита с полистиреново фолио. Срезите бяха оцветени с разтвор на 4% уранил ацетат във вода в продължение на 10 минути, промити с вода няколко пъти, след това с оловен цитрат на Reynolds във вода в продължение на 10 минути и накрая промити с вода няколко пъти. Микрографските снимки бяха направени с трансмисионен електронен микроскоп Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Уолтъм, Масачузетс, САЩ), използвайки цифрова камера TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Гаутинг, САЩ). Германия).
При мишки, заразени с AAV, мозъкът е отделен и нарязан на сагитален разрез с дебелина 1 mm, а малкият мозък е изследван с помощта на флуоресцентен микроскоп, за да се идентифицира пръстенът, заразен с AAV (т.е. експресиращ mCherry). Използват се само експерименти, при които инжектирането на AAV води до много висока трансдукционна ефективност на слоя от клетки на Purkinje (т.е. почти целия слой) в поне два последователни малки пръстена. Трансдуцираната с AAV примка е микродисектирана за последваща фиксация през нощта (4% PFA и 2,5% глутаралдехид в 0,1 M кокоатен буфер) и е допълнително обработена. За вграждане на EPON, фиксираната тъкан е промита с 0,1 M натриев кокоатен буфер (Applichem) и инкубирана с 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) в 0,1 M натриев кокоатен буфер (Applichem) в продължение на 4 часа, след което е промита в продължение на 2 часа. Повторете 3 пъти с 0,1 M кокамиден буфер. Впоследствие, възходящата серия от етанол беше използвана за инкубиране на всеки етанолов разтвор при 4°C в продължение на 15 минути, за да се дехидратира тъканта. Тъканта беше прехвърлена в пропиленоксид и инкубирана за една нощ в EPON (Sigma-Aldrich) при 4°C. Тъканта беше поставена в пресен EPON при стайна температура за 2 часа, след което беше вградена при 62°C за 72 часа. Използвайте ултрамикротом (Leica Microsystems, UC6) и диамантен нож (Diatome, Biel, Швейцария), за да изрежете ултратънки срези с дебелина 70 nm и оцветете с 1,5% уранил ацетат за 15 минути при 37°C и оцветете с разтвор на оловен цитрат за 4 минути. Електронните микрографии бяха направени с помощта на трансмисионен електронен микроскоп JEM-2100 Plus (JEOL), оборудван с Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) и софтуер DigitalMicrograph (Gatan). За анализ, електронните микрографии бяха получени с 5000× или 10 000× цифрово увеличение.
Морфологичен анализ на митохондриите. За всички анализи контурите на отделните митохондрии бяха ръчно очертани в цифрови изображения с помощта на софтуера ImageJ. Анализирани са различни морфологични параметри. Митохондриалната плътност се изразява като процент, получен чрез разделяне на общата митохондриална площ на всяка клетка на площта на цитоплазмата (площ на цитоплазмата = площ на клетката - площ на клетъчното ядро) × 100. Кръглостта на митохондриите се изчислява по формулата [4π∙(площ/периметър 2)]. Анализирана е морфологията на митохондриите и е разделена на две категории („тръбни“ и „мехуровидни“) според основните им форми.
Анализ на броя и плътността на автофагозоми/лизозоми. Използвайте софтуера ImageJ, за да очертаете ръчно контурите на всяка автофагозома/лизозома в цифровото изображение. Площта на автофагозомата/лизозомата се изразява като процент, изчислен чрез разделяне на общата площ на автофагозомната/лизозомната структура на всяка клетка на площта на цитоплазмата (площ на цитоплазмата = площ на клетката - площ на ядрото) × 100. Плътността на автофагозомите/лизозомите се изчислява чрез разделяне на общия брой на броя на автофагозомните/лизозомни структури на клетка (по отношение на цитоплазмената площ) (цитоплазмена площ = площ на клетката - площ на ядрото).
Маркиране за остро секциониране и подготовка на пробите. За експерименти, които изискват маркиране с глюкоза, прехвърлете острите мозъчни срезове в камера за предварителна инкубация, която съдържа наситен въглерод (95% O2 и 5% CO2), висококалоричен ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM натриев фосфатен буфер, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-глюкоза, 1.0 mM CaCl2 и 2.0 mM MgCl2, pH регулирано на 7.4 и 310 до 320 mOsm), в която глюкозата е 13C6-глюкозно заместване (Eurisotop, каталожен номер CLM-1396). За експерименти, които изискват маркиране с пируват, прехвърлете срезите от остър мозък в среда с по-високо съдържание на Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM натриев фосфатен буфер, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-глюкоза, 1.0 mM CaCl2 и добавете 2.0 mM MgCl2, регулирайте до pH 7.4 и от 310 до 320mOsm) и добавете 1 mM 1-[1-13C]пируват (Eurisotop, каталожен номер CLM-1082). Инкубирайте срезите в продължение на 90 минути при 37°C. В края на експеримента срезите бяха бързо промити с воден разтвор (pH 7.4), съдържащ 75 mM амониев карбонат, и след това хомогенизирани в 40:40:20 (v:v:v) ацетонитрил (ACN):метанол:вода. След като срезите бяха инкубирани върху лед в продължение на 30 минути, пробите бяха центрофугирани при 21 000 g за 10 минути при 4°C и бистрият супернатант беше изсушен в концентратор SpeedVac. Получената изсушена метаболитна утайка беше съхранявана при -80°C до анализа.
Течнохроматографско-масспектрометричен анализ на 13C-маркирани аминокиселини. За течнохроматографско-масспектрометричен (LC-MS) анализ, метаболитната утайка беше ресуспендирана в 75 μl вода с клас LC-MS (Honeywell). След центрофугиране при 21 000 g за 5 минути при 4°C, 20 μl от избистрената супернатанта беше използвана за анализ на потока на аминокиселини, докато останалата част от екстракта беше използвана веднага за анионния анализ (виж по-долу). Анализът на аминокиселините беше извършен, като се използваше предварително описаният протокол за дериватизация на бензоилхлорид (55, 56). В първата стъпка, 10 μl 100 mM натриев карбонат (Sigma-Aldrich) беше добавен към 20 μl метаболитен екстракт, след което 10 μl 2% бензоилхлорид (Sigma-Aldrich) беше добавен към ACN с клас LC. Пробата беше разбъркана за кратко на вортекс и след това центрофугирана при 21 000 g за 5 минути при 20°C. Прехвърлете пречистената супернатанта в 2 ml флакон за автосамплер с конична стъклена вложка (обем 200 μl). Пробите бяха анализирани с помощта на Acquity iClass ултрависокопроизводителна LC система (Waters), свързана с Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) прецизен масспектрометър с висока резолюция (Thermo Fisher Scientific). За анализа, 2 μl от дериватизираната проба бяха инжектирани в 100×1.0 mm високоякостен силициев диоксид T3 колона (Waters), съдържаща 1.8 μm частици. Скоростта на потока е 100 μl/min, а буферната система се състои от буфер А (10 mM амониев формиат и 0.15% мравчена киселина във вода) и буфер Б (ACN). Градиентът е следният: 0%B при 0 минути; 0%B. 0 до 15% B при 0 до 0.1 минути; 15 до 17% B при 0.1 до 0.5 минути; B при 17 до 55% при 0,5 до 14 минути; B при 55 до 70% при 14 до 14,5 минути; при 14,5 до 70 до 100% B при 18 минути; 100% B при 18 до 19 минути; 100 до 0% B при 19 до 19,1 минути; 0% B при 19,1 до 28 минути (55, 56). Масспектрометърът QE-HF работи в режим на положителна йонизация с масов диапазон m/z (съотношение маса/заряд) от 50 до 750. Приложената разделителна способност е 60 000, а получената йонна мишена с контрол на усилването (AGC) е 3×106, а максималното йонно време е 100 милисекунди. Източникът на нагрята електроспрей йонизация (ESI) работи при напрежение на пръскане 3,5 kV, температура на капиляра 250°C, въздушен поток на обвивката 60 AU (произволни единици) и спомагателен въздушен поток 20 AU. 250°C. S-лещата е настроена на 60 AU.
Анионна хроматография-MS анализ на 13C маркирани органични киселини. Останалата утайка от метаболит (55 μl) беше анализирана с помощта на йонна хроматографска система Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific), свързана с QE-HF масспектрометър (Thermo Fisher Scientific). Накратко, 5 μl от екстракта от метаболит бяха инжектирани в колона Dionex IonPac AS11-HC, оборудвана с HPLC (2 mm × 250 mm, размер на частиците 4 μm, Thermo Fisher Scientific) в режим на частична циркулация с коефициент на пълнене 1. ) Предпазна колона Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Температурата на колоната се поддържа на 30°C, а автосамплерът е настроен на 6°C. Използвайте патрон с калиев хидроксид, снабден с дейонизирана вода, за да генерирате градиент на калиев хидроксид през генератора на елуент. Разделяне на метаболити при скорост на потока 380μl/min, прилагайки следния градиент: 0 до 3 минути, 10 mM KOH; 3 до 12 минути, 10 до 50 mM KOH; 12 до 19 минути, 50 до 100 mM KOH; 19 до 21 минути, 100 mM KOH; 21 до 21,5 минути, 100 до 10 mM KOH. Колоната беше ре-еквивалибрирана при 10 mM KOH за 8,5 минути.
Елуираните метаболити се комбинират с допълнителен поток от изопропанол със скорост 150 μl/min след колоната и след това се насочват към масспектрометър с висока резолюция, работещ в режим на отрицателна йонизация. MS следи масовия диапазон от m/z 50 до 750 с резолюция 60 000. AGC е настроен на 1×106, а максималното йонно време се поддържа на 100 ms. Нагрятият ESI източник работи при напрежение на пръскане 3,5 kV. Другите настройки на йонния източник са следните: капилярна температура 275°C; поток на обвивния газ, 60 AU; поток на спомагателен газ, 20 AU при 300°C и настройка на S-лещата на 60 AU.
Анализ на данни за белязани с 13C метаболити. Използвайте софтуера TraceFinder (версия 4.2, Thermo Fisher Scientific) за анализ на данни за изотопно съотношение. Идентичността на всяко съединение беше проверена чрез надеждно референтно съединение и анализирана независимо. За да се извърши анализ на изотопно обогатяване, площта на екстрахираната йонна хроматограма (XIC) на всеки 13C изотоп (Mn) беше екстрахирана от [M + H] +, където n е въглеродният брой на целевото съединение, използвано за анализ на аминокиселини, или [MH] + се използва за анализ на аниони. Точността на масата на XIC е по-малка от пет части на милион, а точността на RT е 0,05 минути. Анализът на обогатяване се извършва чрез изчисляване на съотношението на всеки открит изотоп към сумата от всички изотопи на съответното съединение. Тези съотношения са дадени като процентни стойности за всеки изотоп, а резултатите са изразени като моларен процент обогатяване (MPE), както е описано по-рано (42).
Замразената невронна утайка беше хомогенизирана в леденостуден 80% метанол (v/v), разбъркана на вортекс и инкубирана при -20°C за 30 минути. Пробата беше отново разбъркана на вортекс и разбъркана при +4°C за 30 минути. Пробата беше центрофугирана при 21 000 g за 5 минути при 4°C, след което полученият супернатант беше събран и изсушен с помощта на концентратор SpeedVac при 25°C за последващ анализ. Както е описано по-горе, беше извършен LC-MS анализ върху аминокиселините на сортираните клетки. Използвайки TraceFinder (версия 4.2, Thermo Fisher Scientific), беше извършен анализ на данните, използвайки моноизотопната маса на всяко съединение. Квантилна нормализация на данните за метаболитите беше извършена с помощта на софтуерния пакет preprocessCore (57).
Приготвяне на срезове. Мишката беше бързо анестезирана с въглероден диоксид и обезглавена, мозъкът беше бързо изваден от черепа и вибриращият нож, напълнен с лед (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Германия), беше използван за нарязването му на сагитални срези с дебелина от 300 до 375 μm. Студена въглеродна газификация (95% O2 и 5% CO2). Ниско съдържание на Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM натриев фосфатен буфер, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-глюкоза, 1.0 mM CaCl2 и 6.0 mM MgCl2. Регулиране на pH до 7.4 и 310 до 330 mOsm). Прехвърлете получените мозъчни срези в камера, съдържаща по-висок Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM натриев фосфатен буфер, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-глюкоза, 4.0 mM CaCl2 и 3.5 mM MgCl2) pH 7.4 и 310 до 320 mOsm. Съхранявайте срезите за 20 до 30 минути, за да могат да бъдат възстановени преди записване.
Запис. За всички записи е използвана микроскопска маса, оборудвана с фиксирана записваща камера и обектив с 20x увеличение за потапяне във вода (Scientifica). Предполагаемите клетки на Пуркиние са идентифицирани чрез (i) размер на тялото, (ii) анатомично местоположение на малкия мозък и (iii) експресия на флуоресцентния mtYFP репортерен ген. Пластирната пипета с съпротивление на върха от 5 до 11 мегаома се издърпва с боросиликатна стъклена капилярка (GB150-10, 0.86 mm × 1.5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Германия) и хоризонтална пипета Instruments (P-1000, Sutter), Novato, Калифорния. Всички записи са извършени с усилвател ELC-03XS npi patch clamp (npi electronic GmbH, Tam, Германия), който е контролиран от софтуера Signal (версия 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Великобритания). Експериментът е записан при честота на дискретизация 12.5 kHz. Сигналът се филтрира с два късопропускащи Беселови филтъра с гранични честоти съответно 1,3 и 10 kHz. Капацитетът на мембраната и пипетата се компенсира от компенсационната верига, използваща усилвател. Всички експерименти са проведени под контрола на камера Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Германия), която е контролирана от софтуера Hokawo (версия 2.8, Hamamatsu, Gerden, Германия).
Рутинна конфигурация и анализ на цели клетки. Непосредствено преди записване, напълнете пипетата с вътрешния разтвор, съдържащ следните вещества: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM калиев глюконат, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM гуанозин трифосфат (GTP) (Na) и 10.0 mM креатинин фосфат, като pH е регулирано до 7.25, а осмотичното налягане е 290 mOsm (захароза). Веднага след прилагане на сила от 0 pA за разкъсване на мембраната, е измерен мембранният потенциал в покой. Входното съпротивление се измерва чрез прилагане на хиперполяризирани токове от -40, -30, -20 и -10 pA. Измерете величината на напреженията и използвайте закона на Ом, за да изчислите входното съпротивление. Спонтанната активност беше записана в напрежениеви клещи в продължение на 5 минути, а sPSC беше идентифициран и измерен в Igor Pro (версия 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA), използвайки полуавтоматичен скрипт за разпознаване. IV кривата и токът в стационарно състояние се измерват чрез затягане на батерията при различни потенциали (започвайки от -110 mV) и увеличаване на напрежението на стъпки от 5 mV. Производството на AP беше тествано чрез прилагане на деполяризиращ ток. Затегнете клетката при -70 mV, докато прилагате импулс на деполяризиращ токов ток. Регулирайте размера на стъпката на всяка записваща единица поотделно (от 10 до 60 pA). Изчислете максималната AP честота, като ръчно преброите импулсните пикове, които причиняват най-високата AP честота. Прагът на AP се анализира, като се използва втората производна на деполяризационния импулс, който първо задейства един или повече AP.
Конфигурация и анализ на перфорирани пластири. Извършете запис на перфорирани пластири, използвайки стандартни протоколи. Използвайте пипета без АТФ и ГТФ, която не съдържа следните съставки: 128 mM глюконат К, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA и 2 mM MgCl2, и регулирайте pH до 7,2 (с помощта на KOH). АТФ и ГТФ се пропускат от вътреклетъчния разтвор, за да се предотврати неконтролирана пропускливост на клетъчната мембрана. Пипетата с пластир се пълни с вътрешен разтвор, съдържащ амфотерицин (приблизително 200 до 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich), за да се получи запис на перфорирани пластири. Амфотерицинът е разтворен в диметилсулфоксид (крайна концентрация: 0,1 до 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Използваната концентрация на DMSO не е оказала значителен ефект върху изследваните неврони. По време на процеса на пробиване, съпротивлението на канала (Ra) се наблюдава непрекъснато и експериментът започва след стабилизиране на амплитудата на Ra и AP (20-40 минути). Спонтанната активност се измерва в волтажни и/или токови клещи в продължение на 2 до 5 минути. Анализът на данните е извършен с помощта на Igor Pro (версия 7.05.2, WaveMetrics, САЩ), Excel (версия 2010, Microsoft Corporation, Redmond, САЩ) и GraphPad Prism (версия 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). За идентифициране на спонтанни AP се използва плъгинът NeuroMatic v3.0c на IgorPro. AP се идентифицират автоматично, като се използва зададен праг, който се настройва индивидуално за всеки запис. Използвайки интервала на пиковете, се определя честотата на пиковете с максималната моментна честота на пиковете и средната честота на пиковете.
Изолиране на PN. Чрез адаптиране към предварително публикуван протокол, PN бяха пречистени от малкия мозък на мишката на определен етап (58). Накратко, малкият мозък беше дисектиран и смлян в леденостудена дисоциационна среда [без HBSS Ca2+ и Mg2+, допълнена с 20 mM глюкоза, пеницилин (50 U/ml) и стрептомицин (0.05 mg/ml)], след което средата беше смляна в папаин [HBSS, допълнен с 1-цистеин·HCl (1 mg/ml), папаин (16 U/ml) и дезоксирибонуклеаза I (DNase I; 0.1 mg/ml)]. Третира се 30 минути при 30°C. Първо, тъканите се измиват в HBSS среда, съдържаща яйчен слуз (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) и DN-аза (0.1 mg/ml) при стайна температура, за да се предотврати ензимното разграждане, а след това в HBSS среда, съдържаща 20 mM глюкоза. Внимателното смилане в HBSS, пеницилин (50 U/ml), стрептомицин (0.05 mg/ml) и DN-аза (0.1 mg/ml) освобождава единични клетки. Получената клетъчна суспензия се филтрира през 70μm клетъчна цедка, след което клетките се пелетизират чрез центрофугиране (1110 rpm, 5 минути, 4°C) и се ресуспендират в сортираща среда [HBSS, допълнена с 20 mM глюкоза, 20% фетален говежди серум, пеницилин (50 U/ml) и стрептомицин (0.05 mg/ml)]; оценява се клетъчната жизнеспособност с пропидиев йодид и се регулира клетъчната плътност до 1×106 до 2×106 клетки/ml. Преди флоуцитометрията, суспензията се филтрира през клетъчна цедка с размер на отворите 50 μm.
Проточен цитометър. Клетъчното сортиране беше извършено при 4°C с помощта на машина FACSAria III (BD Biosciences) и софтуер FACSDiva (BD Biosciences, версия 8.0.1). Клетъчната суспензия беше сортирана с помощта на дюза 100 μm под налягане от 20 psi със скорост от ~2800 събития/сек. Тъй като традиционните критерии за гейтинг (размер на клетките, бимодална дискриминация и характеристики на разсейване) не могат да гарантират правилното изолиране на PN от други клетъчни типове, стратегията за гейтинг се определя въз основа на директното сравнение на интензитета и автофлуоресценцията на YFP в mitoYFP+ ​​​​и контролните mitoYFP − мишки. YFP се възбужда чрез облъчване на пробата с лазерна линия 488 nm и сигналът се открива с помощта на лентов филтър 530/30 nm. При mitoYFP+ ​​​​мишки, относителната сила на репортерния ген Rosa26-mitoYFP също се използва за разграничаване на фрагменти от невронното тяло и аксона. 7-AAD се възбужда с жълт лазер с дължина на вълната 561 nm и се детектира с лентов филтър с дължина на вълната 675/20 nm, за да се изключат мъртвите клетки. За да се отделят астроцитите едновременно, клетъчната суспензия се оцветява с ACSA-2-APC, след което пробата се облъчва с лазерна линия с дължина на вълната 640 nm и за детектиране на сигнала се използва лентов филтър с дължина на вълната 660/20 nm.
Събраните клетки бяха пелетизирани чрез центрофугиране (1110 rpm, 5 минути, 4°C) и съхранявани при -80°C до употреба. Мишките Mfn2cKO и техните малки са класифицирани в един и същи ден, за да се сведе до минимум процедурната вариабилност. Представянето и анализът на FACS данните бяха извършени с помощта на софтуера FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Както бе споменато по-горе (59), PCR в реално време се използва за изолиране на ДНК от сортираните неврони за последващо количествено определяне на mtDNA. Линейността и праговата чувствителност първоначално бяха тествани чрез провеждане на qPCR върху различен брой клетки. Накратко, съберете 300 PN в лизисен буфер, състоящ се от 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 и протеиназа K (200 ng/ml) и инкубирайте при 55°C в продължение на 120 минути. Клетките бяха допълнително инкубирани при 95°C в продължение на 10 минути, за да се осигури пълно инактивиране на протеиназа K. Използвайки TaqMan сонда (Thermo Fisher), специфична за mt-Nd1, mtDNA беше измерена чрез полуколичествена PCR в системата 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Science, каталожен номер Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, каталожен номер AIVI3E8) и 18S (Thermo Fisher Scientific, каталожен номер Hs99999901_s1) гени.
Приготвяне на протеомна проба. Чрез нагряване на разтвора при 95°C за 10 минути и ултразвукова обработка в лизисен буфер [6 M гуанидин хлорид, 10 mM трис(2-карбоксиетил)фосфин хидрохлорид, 10 mM хлороацетамид и 100 mM трис-лизирани замразени невронни пелети в HCl]. Върху Bioruptor (Diagenode) за 10 минути (30 секунди импулс / 30 секунди пауза). Пробата е разредена 1:10 в 20 mM трис-HCl (pH 8.0), смесена с 300 ng трипсин злато (Promega) и инкубирана за една нощ при 37°C за постигане на пълно смилане. На втория ден пробата е центрофугирана при 20 000 g за 20 минути. Супернатантът е разреден с 0.1% мравчена киселина и разтворът е обезсолен със самостоятелно приготвени StageTips. Пробата беше изсушена в инструмент SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) при 45°C, след което пептидът беше суспендиран в 0,1% мравчена киселина. Всички проби бяха приготвени едновременно от едно и също лице. За да се анализират проби от астроцити, 4 μg обезсолени пептиди бяха маркирани с тандемна масова маркировка (TMT10plex, каталожен номер 90110, Thermo Fisher Scientific) със съотношение пептид към TMT реагент 1:20. За TMT маркиране, 0,8 mg TMT реагент бяха ресуспендирани в 70 μl безводен ACN и изсушеният пептид беше разтворен в 9 μl 0,1 M TEAB (триетиламониев бикарбонат), към който бяха добавени 7 μl TMT реагент в ACN. Концентрацията беше 43,75%. След 60 минути инкубация реакцията беше прекъсната с 2 μl 5% хидроксиламин. Маркираните пептиди бяха събрани, изсушени, ресуспендирани в 200 μl 0,1% мравчена киселина (FA), разделени на две и след това обезсолени с помощта на самостоятелно направени StageTips. Използвайки UltiMate 3000 ултрависокоефективен течен хроматограф (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), едната от двете половини беше фракционирана на 1mm x 150mm Acquity хроматографска колона, напълнена с 130Å1.7μm C18 частици (Waters, каталожен номер SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Разделяйте пептидите при скорост на потока 30 μl/min, разделяйте от 1% до 50% буфер B за 85 минути с поетапен градиент от 96 минути, от 50% до 95% буфер B за 3 минути, след това 8 минути за 95% буфер B; Буфер А е 5% ACN и 10 mM амониев бикарбонат (ABC), а буфер Б е 80% ACN и 10 mM ABC. Събирайте фракциите на всеки 3 минути и ги комбинирайте в две групи (1 + 17, 2 + 18 и т.н.) и ги изсушете във вакуумна центрофуга.
LC-MS/MS анализ. За масспектрометрията, пептидите (номер r119.aq) бяха разделени на аналитична колона PicoFrit с диаметър 25 cm и вътрешен диаметър 75 μm (нов обектив, номер на част PF7508250), оборудвана с 1.9 μm среда ReproSil-Pur 120 C18-AQ (Dr. Maisch, mat), използвайте EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Германия). Колоната беше поддържана при 50°C. Буфери А и В са съответно 0.1% мравчена киселина във вода и 0.1% мравчена киселина в 80% ACN. Пептидите бяха разделени от 6% до 31% буфер В за 65 минути и от 31% до 50% буфер В за 5 минути с градиент от 200 nl/min. Елуираните пептиди бяха анализирани на масспектрометър Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Измерването m/z на пептидния прекурсор се извършва с резолюция от 120 000 в диапазона от 350 до 1500 m/z. Използвайки 27% нормализирана енергия на сблъсък, най-силният прекурсор със зарядно състояние от 2 до 6 се избира за разцепване чрез дисоциация на C капан с висока енергия (HCD). Времето на цикъла е зададено на 1 s. m/z стойността на пептидния фрагмент е измерена в йонния капан, използвайки най-малката AGC мишена от 5×104 и максималното време за инжектиране от 86 ms. След фрагментацията, прекурсорът е поставен в списъка за динамично изключване за 45 s. TMT-маркираните пептиди бяха разделени на 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap колона (Thermo Fisher Scientific, каталожен номер 164942), а миграционните спектри бяха анализирани на Orbitrap Lumos Tribrid масспектрометър (Thermo Fisher Scientific), оборудван с оборудване за асиметрични вълнови йони с високо поле (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific), работещо при две компенсационни напрежения от −50 и −70 V. MS3, избран въз основа на прекурсора на синхронизация, се използва за измерване на TMT йонния сигнал. Разделянето на пептидите беше извършено на EASY-nLC 1200, използвайки 90% линеен градиент на елуиране, с концентрация на буфера от 6% до 31%; буфер А беше 0,1% FA, а буфер B беше 0,1% FA и 80% ACN. Аналитичната колона работи при 50°C. Използвайте FreeStyle (версия 1.6, Thermo Fisher Scientific), за да разделите оригиналния файл според компенсационното напрежение FAIMS.
Идентифициране и количествено определяне на протеини. С помощта на интегрираната търсачка Andromeda, оригиналните данни бяха анализирани с помощта на MaxQuant версия 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). В допълнение към Cre рекомбиназата и YFP последователностите, получени от Aequorea victoria, бяха търсени спектри на пептидни фрагменти за каноничната последователност и изоформната последователност на мишия референтен протеом (Proteome ID UP000000589, изтеглен от UniProt през май 2017 г.). Окислението на метионина и N-терминалното ацетилиране на протеина бяха зададени като променливи модификации; метилирането на цистеин карбамоил беше зададено като фиксирани модификации. Параметрите на смилане са зададени на „специфичност“ и „трипсин/P“. Минималният брой пептиди и razor пептиди, използвани за идентификация на протеини, е 1; минималният брой уникални пептиди е 0. При условията на съвпадение на пептидни карти, процентът на идентификация на протеини беше 0.01. Опцията „Втори пептид“ е активирана. Използвайте опцията „съвпадение между изпълнения“, за да прехвърлите успешни идентификации между различни оригинални файлове. Използвайте LFQ минимално съотношение брой 1 за количествено определяне без етикети (LFQ) (60). Интензитетът на LFQ се филтрира за поне две валидни стойности в поне една генотипна група във всяка времева точка и се екстраполира от нормално разпределение с ширина 0,3 и надолу 1,8. Използвайте Perseus изчислителна платформа (https://maxquant.net/perseus/) и R (https://r-project.org/) за анализ на LFQ резултатите. За диференциален експресионен анализ е използван двуфакторен умерен t-тест от софтуерния пакет limma (61). Извършен е изследователски анализ на данните с помощта на ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally и pheatmap. Данните от протеомиката, базирани на TMT, са анализирани с помощта на MaxQuant версия 1.6.10.43. Търсете сурови протеомични данни от базата данни за човешка протеомика на UniProt, която е изтеглена през септември 2018 г. Анализът включва корекционния коефициент за изотопна чистота, предоставен от производителя. Използвайте limma в R за анализ на диференциални изрази. Оригиналните данни, резултатите от търсенето в базата данни и работният процес и резултатите от анализа на данни се съхраняват в алианса ProteomeXchange чрез партньорското хранилище PRIDE с идентификатор на набора от данни PXD019690.
Функционалните анотации обогатяват анализа. Инструментът Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) беше използван за определяне на богатството на термините за функционални анотации на набора от данни на 8 седмици (Фигура 1). Накратко, количественият списък с протеини, получен от анализ на данни с LC-MS/MS (тандемна масспектрометрия), се използва със следните критерии за филтриране: Mus musculus е избран като вид и фон, а категорията показва, че P стойността, коригирана от Benjamini за обогатяване 0,05 или по-ниска, се счита за значима. За тази графика са показани петте най-големи излишни категории във всеки клъстер въз основа на коригираната P стойност. Използвайки множествен t-тест, използвайки двустепенната линейна програма за усилване на Benjamini, Krieger и Yekutieli (Q = 5%), се извършва анализ на експресията на протеини във времето върху важните кандидати, идентифицирани във всяка категория, и всеки ред се анализира отделно. Няма нужда да се приема последователно стандартно отклонение (SD).
За да сравним резултатите от това проучване с публикувани бази данни и да генерираме диаграма на Вен на Фигура 1, комбинирахме количествения списък с протеини с анотации от MitoCarta 2.0 (24). Използвайте онлайн инструмента Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/), за да генерирате диаграмата.
За подробна информация относно статистическите процедури, използвани за протеомичен анализ, моля, вижте съответния раздел „Материали и методи“. За всички останали експерименти подробна информация може да бъде намерена в съответната легенда. Освен ако не е посочено друго, всички данни са изразени като средна стойност ± SEM и всички статистически анализи са извършени с помощта на софтуера GraphPad Prism 8.1.2.
За допълнителни материали към тази статия, моля, вижте http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Това е статия с отворен достъп, разпространявана съгласно условията на Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, който позволява използването, разпространението и възпроизвеждането във всякакъв носител, стига крайната употреба да не е за търговска печалба и предпоставката е, че оригиналното произведение е коректно. Справка.
Забележка: Молим ви да предоставите имейл адреса си само за да знае човекът, когото препоръчвате на страницата, че искате да види имейла и че не е спам. Няма да събираме никакви имейл адреси.
Този въпрос се използва, за да се провери дали сте посетител и да се предотврати автоматичното изпращане на спам.
От Е. Мотори, И. Атанасов, С. В. Кочан, К. Фолц-Донахю, В. Сактивелу, П. Джавалиско, Н. Тони, Дж. Пуял, Н.-Г. Ларсън
Протеомният анализ на дисфункционалните неврони разкри, че метаболитните програми се активират, за да противодействат на невродегенерацията.
От Е. Мотори, И. Атанасов, С. В. Кочан, К. Фолц-Донахю, В. Сактивелу, П. Джавалиско, Н. Тони, Дж. Пуял, Н.-Г. Ларсън
Протеомният анализ на дисфункционалните неврони разкри, че метаболитните програми се активират, за да противодействат на невродегенерацията.
©2020 Американска асоциация за напредък на науката. всички права запазени. AAAS е партньор на HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.