Статията е част от изследователската тема „Разширени технологии за биоремедиация и процеси за рециклиране на синтетични органични съединения (SOC). Вижте всички 14 статии
Нискомолекулните полициклични ароматни въглеводороди (ПАВ), като нафталин и заместени нафталени (метилнафталин, нафтоена киселина, 1-нафтил-N-метилкарбамат и др.), се използват широко в различни индустрии и са генотоксични, мутагенни и/или канцерогенни за организмите. Тези синтетични органични съединения (СОС) или ксенобиотици се считат за приоритетни замърсители и представляват сериозна заплаха за глобалната околна среда и общественото здраве. Интензивността на човешките дейности (напр. газификация на въглища, рафиниране на нефт, емисии от превозни средства и селскостопански приложения) определя концентрацията, съдбата и транспорта на тези повсеместни и устойчиви съединения. В допълнение към методите за физическа и химическа обработка/отстраняване, зелените и екологично чисти технологии, като биоремедиацията, които използват микроорганизми, способни напълно да разградят ПОС или да ги превърнат в нетоксични странични продукти, се очертават като безопасна, рентабилна и обещаваща алтернатива. Различни бактериални видове, принадлежащи към фила Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia и Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus и Paenibacillus) и Actinobacteria (Rhodococcus и Arthrobacter) в почвената микробиота, са демонстрирали способността си да разграждат различни органични съединения. Метаболитните изследвания, геномиката и метагеномният анализ ни помагат да разберем катаболната сложност и разнообразие, присъстващи в тези прости форми на живот, които могат да бъдат приложени допълнително за ефективно биоразграждане. Дългосрочното съществуване на полицикличните ароматни въглеводороди (ПАВ) е довело до появата на нови фенотипове на разграждане чрез хоризонтален трансфер на гени, използвайки генетични елементи като плазмиди, транспозони, бактериофаги, геномни острови и интегративни конюгиращи елементи. Системната биология и генното инженерство на специфични изолати или моделни общности (консорциуми) могат да позволят цялостна, бърза и ефикасна биоремедиация на тези ПАВ чрез синергични ефекти. В този преглед се фокусираме върху различните метаболитни пътища и разнообразие, генетичния състав и разнообразие, както и клетъчните отговори/адаптации на бактериите, разграждащи нафталин и заместен нафталин. Това ще предостави екологична информация за полево приложение и оптимизиране на щамовете за ефективна биоремедиация.
Бързото развитие на индустриите (нефтохимикали, селско стопанство, фармацевтика, текстилни багрила, козметика и др.) допринесе за глобалния икономически просперитет и подобряване на жизнения стандарт. Това експоненциално развитие доведе до производството на голям брой синтетични органични съединения (СОС), които се използват за производството на различни продукти. Тези чужди съединения или СОС включват полициклични ароматни въглеводороди (ПАВ), пестициди, хербициди, пластификатори, багрила, фармацевтични продукти, органофосфати, забавители на горенето, летливи органични разтворители и др. Те се емитират в атмосферата, водните и сухоземните екосистеми, където имат многоизмерно въздействие, причинявайки вредни ефекти върху различни биоформи чрез промяна на физикохимичните свойства и структурата на съобществата (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Много ароматни замърсители имат силно и разрушително въздействие върху много непокътнати екосистеми/горещи точки на биоразнообразие (напр. коралови рифове, арктически/антарктически ледени покривки, високопланински езера, дълбоководни седименти и др.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Последните геомикробиологични проучвания показват, че отлагането на синтетични органични вещества (напр. ароматни замърсители) и техните производни върху повърхностите на изкуствени структури (застроена среда) (напр. обекти на културното наследство и паметници, изработени от гранит, камък, дърво и метал) ускорява тяхното разграждане (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Човешките дейности могат да засилят и влошат биологичното разграждане на паметници и сгради чрез замърсяване на въздуха и изменение на климата (Liu et al. 2020). Тези органични замърсители реагират с водните пари в атмосферата и се отлагат върху конструкцията, причинявайки физическо и химическо разграждане на материала. Биоразграждането е широко признато като нежелани промени във външния вид и свойствата на материалите, причинени от живи организми, които влияят върху тяхното запазване (Pochon and Jaton, 1967). По-нататъшното микробно действие (метаболизъм) на тези съединения може да намали структурната цялост, ефективността на опазването и културната стойност (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). От друга страна, в някои случаи е установено, че микробната адаптация и реакция към тези структури са полезни, тъй като те образуват биофилми и други защитни корички, които намаляват скоростта на разпадане/разлагане (Martino, 2016). Следователно, разработването на ефективни дългосрочни устойчиви стратегии за опазване на каменни, метални и дървени паметници изисква задълбочено разбиране на ключовите процеси, участващи в този процес. В сравнение с естествените процеси (геоложки процеси, горски пожари, вулканични изригвания, растителни и бактериални реакции), човешките дейности водят до отделянето на големи обеми полициклични ароматни въглеводороди (ПАВ) и друг органичен въглерод (ОС) в екосистемите. Много полициклични ароматни въглеводороди (ПАВ), използвани в селското стопанство (инсектициди и пестициди като ДДТ, атразин, карбарил, пентахлорофенол и др.), промишлеността (суров петрол, нефтени утайки/отпадъци, пластмаси, получени от петрол, ПХБ, пластификатори, детергенти, дезинфектанти, фумиганти, ароматизатори и консерванти), продуктите за лична хигиена (слънцезащитни продукти, дезинфектанти, репеленти против насекоми и полициклични мускуси) и боеприпасите (взривни вещества като 2,4,6-ТНТ), са потенциални ксенобиотици, които могат да повлияят на здравето на планетата (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna and Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Този списък може да бъде разширен, за да включва съединения, получени от петрол (горива, смазочни материали, асфалтени), биопластмаси с високо молекулно тегло и йонни течности (Amde et al., 2015). Таблица 1 изброява различни ароматни замърсители и техните приложения в различни индустрии. През последните години антропогенните емисии на летливи органични съединения, както и на въглероден диоксид и други парникови газове, започнаха да се увеличават (Dvorak et al., 2017). Антропогенните въздействия обаче значително надвишават естествените. Освен това установихме, че редица органични съединения (SOC) се срещат в много екологични среди и са идентифицирани като нововъзникващи замърсители с неблагоприятно въздействие върху биомите (Фигура 1). Екологични агенции, като Агенцията за опазване на околната среда на Съединените щати (USEPA), са включили много от тези замърсители в своя списък с приоритети поради техните цитотоксични, генотоксични, мутагенни и канцерогенни свойства. Следователно са необходими строги разпоредби за обезвреждане и ефективни стратегии за третиране/отстраняване на отпадъци от замърсени екосистеми. Различни физични и химични методи за третиране, като пиролиза, окислително термично третиране, аериране на въздуха, депониране, изгаряне и др., са неефективни и скъпи и генерират корозивни, токсични и трудни за третиране странични продукти. С нарастващата глобална екологична осведоменост, микроорганизмите, способни да разграждат тези замърсители и техните производни (като халогенирани, нитро, алкилови и/или метилови), привличат все по-голямо внимание (Fennell et al., 2004; Haritash and Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Използването на тези местни кандидат-микроорганизми самостоятелно или в смесени култури (колонии) за отстраняване на ароматни замърсители има предимства по отношение на екологичната безопасност, разходите, ефективността, ефикасността и устойчивостта. Изследователите също така проучват интегрирането на микробните процеси с електрохимични редокс методи, а именно биоелектрохимични системи (BES), като обещаваща технология за третиране/отстраняване на замърсители (Huang et al., 2011). Технологията BES привлича все по-голямо внимание поради високата си ефективност, ниската цена, екологичната безопасност, работата при стайна температура, биосъвместимите материали и способността за възстановяване на ценни странични продукти (напр. електричество, гориво и химикали) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Появата на високопроизводително геномно секвениране и инструменти/методи за омика (омикс) предостави богатство от нова информация за генетичната регулация, протеомиката и флуксомиката на реакциите на различни микроорганизми разграждащи вещества. Комбинирането на тези инструменти със системната биология допълнително подобри разбирането ни за селекцията и фината настройка на целевите катаболни пътища в микроорганизмите (т.е. метаболитен дизайн), за да се постигне ефикасно и ефективно биоразграждане. За да проектираме ефективни стратегии за биоремедиация, използвайки подходящи кандидат микроорганизми, трябва да разберем биохимичния потенциал, метаболитното разнообразие, генетичния състав и екологията (автоекология/синекология) на микроорганизмите.
Фиг. 1. Източници и пътища на нискомолекулни ПАВ през различни среди на околната среда и различни фактори, влияещи върху биотата. Пунктираните линии представляват взаимодействията между елементите на екосистемата.
В този преглед се опитахме да обобщим данните за разграждането на прости ПАВ, като нафталин и заместени нафталени, от различни бактериални изолати, обхващащи метаболитни пътища и разнообразие, ензими, участващи в разграждането, генен състав/съдържание и разнообразие, клетъчни отговори и различни аспекти на биоремедиацията. Разбирането на биохимичните и молекулярните нива ще помогне за идентифицирането на подходящи щамове гостоприемници и тяхното по-нататъшно генно инженерство за ефективна биоремедиация на такива приоритетни замърсители. Това ще помогне за разработването на стратегии за създаване на специфични за мястото бактериални консорциуми за ефективна биоремедиация.
Наличието на голям брой токсични и опасни ароматни съединения (удовлетворяващи правилото на Хюкел 4n + 2π електрона, n = 1, 2, 3, ...) представлява сериозна заплаха за различни екологични среди, като въздух, почва, седименти, повърхностни и подземни води (Puglisi et al., 2007). Тези съединения имат единични бензенови пръстени (моноциклични) или множество бензенови пръстени (полициклични), подредени в линейна, ъглова или клъстерна форма, и проявяват стабилност (стабилност/нестабилност) в околната среда поради високата отрицателна резонансна енергия и инертност (инертност), което може да се обясни с тяхната хидрофобност и редуцирано състояние. Когато ароматният пръстен е допълнително заменен с метилови (-CH3), карбоксилни (-COOH), хидроксилни (-OH) или сулфонатни (-HSO3) групи, той става по-стабилен, има по-силен афинитет към макромолекули и е биоакумулативен в биологични системи (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Някои нискомолекулни полициклични ароматни въглеводороди (НМВАХ), като нафталин и неговите производни [метилнафталин, нафтоена киселина, нафталинсулфонат и 1-нафтил N-метилкарбамат (карбарил)], са включени в списъка на приоритетните органични замърсители от Агенцията за опазване на околната среда на САЩ като генотоксични, мутагенни и/или канцерогенни (Cerniglia, 1984). Освобождаването на този клас НМ-ПАХ в околната среда може да доведе до биоакумулиране на тези съединения на всички нива на хранителната верига, като по този начин се отрази на здравето на екосистемите (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Източниците и пътищата на попадане на ПАВ към биотата са предимно чрез миграция и взаимодействия между различни компоненти на екосистемата, като почва, подпочвени води, повърхностни води, култури и атмосфера (Arey and Atkinson, 2003). Фигура 1 показва взаимодействията и разпределението на различни нискомолекулни ПАВ в екосистемите и техните пътища към биотата/човешката експозиция. ПАВ се отлагат върху повърхностите в резултат на замърсяване на въздуха и чрез миграцията (дрейфа) на емисии от превозни средства, промишлени отработени газове (газификация на въглища, горене и производство на кокс) и тяхното отлагане. Промишлени дейности като производството на синтетичен текстил, багрила и бои; консервиране на дървесина; преработка на каучук; производство на цимент; производство на пестициди; и селскостопански приложения са основни източници на ПАВ в сухоземните и водните системи (Bamforth and Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Проучвания показват, че почвите в крайградските и градските райони, в близост до магистрали и в големите градове са по-податливи на полициклични ароматни въглеводороди (ПАВ) поради емисии от електроцентрали, отопление на жилища, въздушен и пътен трафик, както и строителни дейности (Suman et al., 2016). (2008) показва, че ПАВ в почвата в близост до пътища в Ню Орлиънс, Луизиана, САЩ, са високи до 7189 μg/kg, докато в открито пространство те са само 2404 μg/kg. По подобен начин, нива на ПАВ до 300 μg/kg са докладвани в райони в близост до места за газификация на въглища в няколко града в САЩ (Kanaly and Harayama, 2000; Bamforth and Singleton, 2005). Съобщава се, че почви от различни индийски градове като Делхи (Sharma et al., 2008), Агра (Dubey et al., 2014), Мумбай (Kulkarni and Venkataraman, 2000) и Висакхапатнам (Kulkarni et al., 2014) съдържат високи концентрации на ПАВ. Ароматните съединения се адсорбират по-лесно върху почвените частици, органичната материя и глинестите минерали, като по този начин се превръщат в основни поглътители на въглерод в екосистемите (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Основните източници на ПАВ във водните екосистеми са валежите (мокри/сухи валежи и водни пари), градският отток, заустването на отпадъчни води, презареждането на подземните води и др. (Srogi, 2007). Смята се, че около 80% от ПАВ в морските екосистеми произлизат от валежи, утаяване и заустване на отпадъци (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). По-високи концентрации на ПАВ в повърхностните води или инфилтрата от депата за твърди отпадъци в крайна сметка проникват в подпочвените води, което представлява сериозна заплаха за общественото здраве, тъй като повече от 70% от населението в Южна и Югоизточна Азия пие подпочвени води (Duttagupta et al., 2019). Неотдавнашно проучване на Duttagupta et al. (2020) на речни (32) и подпочвени (235) анализи от Западна Бенгалия, Индия, установи, че приблизително 53% от градските жители и 44% от селските жители (общо 20 милиона жители) може да са изложени на нафталин (4,9–10,6 μg/L) и неговите производни. Различните модели на земеползване и увеличеният добив на подпочвени води се считат за основните фактори, контролиращи вертикалния транспорт (адвекция) на нискомолекулни ПАВ в подземните води. Установено е, че селскостопанският отток, заустванията на битови и промишлени отпадъчни води и заустванията на твърди отпадъци/боклук са засегнати от ПАВ в речните басейни и подземните седименти. Атмосферните валежи допълнително влошават замърсяването с ПАВ. Високи концентрации на ПАВ и техните алкилови производни (общо 51) са докладвани в реки/водосборни басейни по целия свят, като например реките Фрейзър, Луан, Денсо, Мисури, Анакостия, Ебро и Делауеър (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). В седиментите от басейна на река Ганг нафталинът и фенантренът са установени като най-значими (открити в 70% от пробите) (Duttagupta et al., 2019). Освен това, проучвания показват, че хлорирането на питейна вода може да доведе до образуването на по-токсични оксидирани и хлорирани ПАВ (Manoli and Samara, 1999). ПАВ се натрупват в зърнени култури, плодове и зеленчуци в резултат на усвояването им от растенията от замърсени почви, подпочвени води и валежи (Fismes et al., 2002). Много водни организми, като риби, миди, ракообразни и скариди, са замърсени с ПАВ чрез консумацията на замърсена храна и морска вода, както и чрез тъкани и кожа (Mackay and Fraser, 2000). Методи за готвене/обработка, като печене на скара, печене, опушване, пържене, сушене, печене и готвене на дървени въглища, също могат да доведат до значителни количества ПАВ в храната. Това до голяма степен зависи от избора на материал за пушене, съдържанието на фенолни/ароматни въглеводороди, процедурата на готвене, вида на нагревателя, съдържанието на влага, подаването на кислород и температурата на горене (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Полициклични ароматни въглеводороди (ПАВ) също са открити в млякото в различни концентрации (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). Натрупването на тези ПАВ в храната също зависи от физикохимичните свойства на храната, докато токсичните им ефекти са свързани с физиологичните функции, метаболитната активност, абсорбцията, разпределението и разпределението в тялото (Mechini et al., 2011).
Токсичността и вредните ефекти на полицикличните ароматни въглеводороди (ПАВ) са известни отдавна (Cherniglia, 1984). Нискомолекулните полициклични ароматни въглеводороди (НММ-ПАВ) (с два до три пръстена) могат ковалентно да се свързват с различни макромолекули като ДНК, РНК и протеини и са канцерогенни (Santarelli et al., 2008). Поради хидрофобната си природа, те са разделени от липидни мембрани. При хората, цитохром P450 монооксигеназите окисляват ПАВ до епоксиди, някои от които са силно реактивни (напр. бедиол епоксид) и могат да доведат до трансформация на нормални клетки в злокачествени (Marston et al., 2001). Освен това, продуктите от трансформацията на ПАВ, като хинони, феноли, епоксиди, диоли и др., са по-токсични от изходните съединения. Някои ПАВ и техните метаболитни междинни продукти могат да повлияят на хормоните и различни ензими в метаболизма, като по този начин окажат неблагоприятно въздействие върху растежа, централната нервна система, репродуктивната и имунната система (Swetha and Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Съобщава се, че краткосрочното излагане на ПАВ с ниско молекулно тегло причинява нарушена белодробна функция и тромбоза при астматици и увеличава риска от рак на кожата, белите дробове, пикочния мехур и стомашно-чревния тракт (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Проучвания върху животни също показват, че излагането на ПАВ може да има неблагоприятни ефекти върху репродуктивната функция и развитието и може да причини катаракта, увреждане на бъбреците и черния дроб и жълтеница. Различни продукти от биотрансформацията на ПАВ, като диоли, епоксиди, хинони и свободни радикали (катиони), образуват ДНК адукти. Доказано е, че стабилните адукти променят механизма за репликация на ДНК, докато нестабилните адукти могат да депуринират ДНК (главно до аденин, а понякога и до гуанин); и двете могат да генерират грешки, които водят до мутации (Schweigert et al. 2001). Освен това, хиноните (бензо-/пан-) могат да генерират реактивни кислородни видове (ROS), причинявайки фатални увреждания на ДНК и други макромолекули, като по този начин засягат функцията/жизнеспособността на тъканите (Ewa and Danuta 2017). Съобщава се, че хроничното излагане на ниски концентрации на пирен, бифенил и нафтален причинява рак при опитни животни (Diggs et al. 2012). Поради тяхната летална токсичност, почистването/отстраняването на тези полициклични ароматни въглеводороди (PAH) от засегнатите/замърсени места е приоритет.
Различни физични и химични методи са били използвани за отстраняване на ПАВ от замърсени места/среди. Процеси като изгаряне, дехлориране, UV окисление, фиксиране и екстракция с разтворител имат много недостатъци, включително образуването на токсични странични продукти, сложност на процеса, проблеми с безопасността и регулаторните изисквания, ниска ефективност и висока цена. Микробното биоразграждане (наречено биоремедиация) обаче е обещаващ алтернативен подход, който включва използването на микроорганизми под формата на чисти култури или колонии. В сравнение с физичните и химичните методи, този процес е екологичен, неинвазивен, рентабилен и устойчив. Биоремедиацията може да се извърши на засегнатото място (in situ) или на специално подготвено място (ex situ) и следователно се счита за по-устойчив метод за ремедиация от традиционните физични и химични методи (Juhasz and Naidu, 2000; Andreoni and Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Разбирането на микробните метаболитни стъпки, участващи в разграждането на ароматните замърсители, има огромни научни и икономически последици за екологичната и екологичната устойчивост. Приблизително 2,1×10^18 грама въглерод (C) се съхраняват в седименти и органични съединения (т.е. нефт, природен газ и въглища, т.е. изкопаеми горива) по целия свят, което прави значителен принос за глобалния въглероден цикъл. Бързата индустриализация, добива на изкопаеми горива и човешките дейности обаче изчерпват тези литосферни въглеродни резервоари, освобождавайки приблизително 5,5×10^15 г органичен въглерод (като замърсители) в атмосферата годишно (Gonzalez-Gaya et al., 2019). По-голямата част от този органичен въглерод навлиза в сухоземните и морските екосистеми чрез утаяване, транспорт и оттичане. Освен това, нови синтетични замърсители, получени от изкопаеми горива, като пластмаси, пластификатори и пластмасови стабилизатори (фталати и техните изомери), сериозно замърсяват морските, почвените и водните екосистеми и тяхната биота, като по този начин изострят глобалните климатични рискове. Различни видове микропластмаси, нанопластмаси, пластмасови фрагменти и техните токсични мономерни продукти, получени от полиетилен терефталат (PET), са се натрупали в Тихия океан между Северна Америка и Югоизточна Азия, образувайки „Голямото тихоокеанско боклуково петно“, увреждайки морския живот (Newell et al., 2020). Научните изследвания са доказали, че не е възможно да се отстранят такива замърсители/отпадъци чрез никакви физични или химични методи. В този контекст най-полезните микроорганизми са тези, способни да окислително метаболизират замърсителите във въглероден диоксид, химическа енергия и други нетоксични странични продукти, които в крайна сметка влизат в други процеси на кръговрат на хранителните вещества (H, O, N, S, P, Fe и др.). Следователно, разбирането на микробната екофизиология на минерализацията на ароматните замърсители и нейния екологичен контрол е от решаващо значение за оценката на микробния въглероден цикъл, нетния въглероден бюджет и бъдещите климатични рискове. Предвид спешната необходимост от отстраняване на такива съединения от околната среда, се появиха различни екоиндустрии, фокусирани върху чисти технологии. Алтернативно, оползотворяването на промишлените отпадъци/отпадъчни химикали, натрупани в екосистемите (т.е. подходът „отпадъци към богатство“) се счита за един от стълбовете на кръговата икономика и целите за устойчиво развитие (Close et al., 2012). Следователно, разбирането на метаболитните, ензимните и генетичните аспекти на тези потенциални кандидати за разграждане е от изключителна важност за ефективното отстраняване и биоремедиация на такива ароматни замърсители.
Сред многото ароматни замърсители, ние обръщаме специално внимание на нискомолекулните ПАВ, като нафталин и заместени нафталени. Тези съединения са основни компоненти на горива, получени от петрол, текстилни багрила, потребителски продукти, пестициди (нафталин и репеленти против насекоми), пластификатори и танини и следователно са широко разпространени в много екосистеми (Preuss et al., 2003). Последните доклади подчертават натрупването на концентрации на нафталин във водоносни седименти, подземни води и подземни почви, вадозни зони и речни корита, което предполага неговото биоакумулиране в околната среда (Duttagupta et al., 2019, 2020). Таблица 2 обобщава физикохимичните свойства, приложенията и здравните ефекти на нафталина и неговите производни. В сравнение с други високомолекулни ПАВ, нафталинът и неговите производни са по-малко хидрофобни, по-разтворими във вода и широко разпространени в екосистемите, така че често се използват като моделни субстрати за изучаване на метаболизма, генетиката и метаболитното разнообразие на ПАВ. Голям брой микроорганизми са способни да метаболизират нафталин и неговите производни и е налична изчерпателна информация за техните метаболитни пътища, ензими и регулаторни характеристики (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Освен това, нафталинът и неговите производни са определени като прототипни съединения за оценка на замърсяването на околната среда поради високото им разпространение и бионаличност. Агенцията за опазване на околната среда на САЩ изчислява, че средните нива на нафталин са 5,19 μg на кубичен метър от цигарения дим, предимно от непълно горене, и 7,8 до 46 μg от страничния дим, докато излагането на креозот и нафталин е 100 до 10 000 пъти по-високо (Preuss et al. 2003). Установено е, че нафталинът по-специално има специфична за вида, региона и пола респираторна токсичност и канцерогенност. Въз основа на проучвания върху животни, Международната агенция за изследване на рака (IARC) е класифицирала нафталин като „възможен канцероген за човека“ (Група 2B)1. Излагането на заместени нафталени, предимно чрез инхалация или парентерално (орално) приложение, причинява увреждане на белодробната тъкан и увеличава честотата на белодробни тумори при плъхове и мишки (Национална токсикологична програма 2). Острите ефекти включват гадене, повръщане, коремна болка, диария, главоболие, объркване, обилно изпотяване, треска, тахикардия и др. От друга страна, широкоспектърният карбаматен инсектицид карбарил (1-нафтил N-метилкарбамат) е съобщаван като токсичен за водните безгръбначни, земноводни, медоносни пчели и хора и е доказано, че инхибира ацетилхолинестеразата, причинявайки парализа (Smulders et al., 2003; Bulen and Distel, 2011). Следователно, разбирането на механизмите на микробно разграждане, генетичната регулация, ензимните и клетъчните реакции е от решаващо значение за разработването на стратегии за биоремедиация в замърсена среда.
Таблица 2. Подробна информация за физикохимичните свойства, употребата, методите за идентификация и свързаните с тях заболявания на нафталина и неговите производни.
В замърсените ниши, хидрофобните и липофилните ароматни замърсители могат да причинят различни клетъчни ефекти върху екологичния микробиом (съобщество), като например промени в мембранната флуидност, мембранна пропускливост, подуване на липидния бислой, нарушаване на енергийния трансфер (електронно-транспортна верига/протонна движеща сила) и активност на мембранно-асоциираните протеини (Sikkema et al., 1995). Освен това, някои разтворими междинни продукти като катехоли и хинони генерират реактивни кислородни видове (ROS) и образуват адукти с ДНК и протеини (Penning et al., 1999). По този начин, изобилието от такива съединения в екосистемите упражнява селективен натиск върху микробните съобщества да станат ефективни разграждащи вещества на различни физиологични нива, включително усвояване/транспорт, вътреклетъчна трансформация, асимилация/утилизация и компартментализация.
Търсене в Ribosomal Database Project-II (RDP-II) разкри, че общо 926 бактериални вида са изолирани от среди или обогатителни култури, замърсени с нафталин или негови производни. Групата Proteobacteria има най-голям брой представители (n = 755), следвана от Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) и некласифицирани бактерии (8) (Фигура 2). Представители на γ-Proteobacteria (Pseudomonadales и Xanthomonadales) доминират във всички Грам-отрицателни групи с високо съдържание на G+C (54%), докато Clostridiales и Bacillales (30%) са Грам-положителни групи с ниско съдържание на G+C. Съобщава се, че Pseudomonas (най-голям брой, 338 вида) са способни да разграждат нафталин и неговите метилови производни в различни замърсени екосистеми (въглен катран, петрол, суров петрол, утайки, нефтени разливи, отпадъчни води, органични отпадъци и депа за отпадъци), както и в непокътнати екосистеми (почва, реки, седименти и подземни води) (Фигура 2). Освен това, проучвания за обогатяване и метагеномен анализ на някои от тези региони разкриха, че некултивираните видове Legionella и Clostridium може да имат разграждащ капацитет, което показва необходимостта от култивиране на тези бактерии за изучаване на нови пътища и метаболитно разнообразие.
Фиг. 2. Таксономично разнообразие и екологично разпространение на бактериални представители в среди, замърсени с нафталин и нафталенови производни.
Сред различните микроорганизми, разграждащи ароматни въглеводороди, повечето са способни да разграждат нафталин като единствен източник на въглерод и енергия. Последователността от събития, участващи в метаболизма на нафталин, е описана за Pseudomonas sp. (щамове: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 и CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 и други щамове (ND6 и AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis and Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Метаболизмът се инициира от многокомпонентна диоксигеназа [нафтален диоксигеназа (NDO), пръстенно хидроксилираща диоксигеназа], която катализира окислението на един от ароматните пръстени на нафталина, използвайки молекулен кислород като друг субстрат, превръщайки нафталина в цис-нафталендиол (Фигура 3). Цис-дихидродиолът се превръща в 1,2-дихидроксинафтален чрез дехидрогеназа. Дехидрогеназа, разцепваща пръстена... Диоксигеназата, 1,2-дихидроксинафтален диоксигеназа (12DHNDO), превръща 1,2-дихидроксинафталена в 2-хидроксихромен-2-карбоксилна киселина. Ензимната цис-транс изомеризация произвежда транс-о-хидроксибензилиденпируват, който се разцепва от хидратазна алдолаза до салицилов алдехид и пируват. Органичната киселина пируват е първото C3 съединение, получено от въглеродния скелет на нафталина и насочено към централния въглероден път. Освен това, NAD+-зависимата салицилалдехид дехидрогеназа превръща салицилалдехида в салицилова киселина. Метаболизмът на този етап се нарича „горен път“ на разграждане на нафталина. Този път е много често срещан при повечето бактерии, разграждащи нафталин. Има обаче няколко изключения; например, при термофилния Bacillus hamburgii 2, разграждането на нафталина се инициира от нафтален 2,3-диоксигеназа, за да се образува... 2,3-дихидроксинафтален (Annweiler et al., 2000).
Фигура 3. Пътища на разграждане на нафталин, метилнафталин, нафтоена киселина и карбарил. Оградените числа представляват ензими, отговорни за последователното превръщане на нафталин и неговите производни в последващи продукти. 1 — нафтален диоксигеназа (NDO); 2, цис-дихидродиол дехидрогеназа; 3, 1,2-дихидроксинафтален диоксигеназа; 4, 2-хидроксихромен-2-карбоксилнокиселинна изомераза; 5, транс-О-хидроксибензилиденпируват хидратаза алдолаза; 6, салицилалдехид дехидрогеназа; 7, салицилат 1-хидроксилаза; 8, катехол 2,3-диоксигеназа (C23DO); 9, 2-хидроксимуконат семиалдехид дехидрогеназа; 10, 2-оксопент-4-еноат хидратаза; 11, 4-хидрокси-2-оксопентaноат алдолаза; 12, ацеталдехид дехидрогеназа; 13, катехол-1,2-диоксигеназа (C12DO); 14, муконат циклоизомераза; 15, муконолактон делта-изомераза; 16, β-кетоадипатенолактон хидролаза; 17, β-кетоадипат сукцинил-CoA трансфераза; 18, β-кетоадипат-CoA тиолаза; 19, сукцинил-CoA: ацетил-CoA сукцинилтрансфераза; 20, салицилат 5-хидроксилаза; 21 – гентизат 1,2-диоксигеназа (GDO); 22, малеилпируват изомераза; 23, фумарилпируват хидролаза; 24, метилнафтален хидроксилаза (NDO); 25, хидроксиметилнафтален дехидрогеназа; 26, нафталехид дехидрогеназа; 27, 3-формилсалицилова киселинна оксидаза; 28, хидроксиизофталат декарбоксилаза; 29, карбарил хидролаза (CH); 30, 1-нафтол-2-хидроксилаза.
В зависимост от организма и неговия генетичен състав, получената салицилова киселина се метаболизира допълнително или чрез катехоловия път, използвайки салицилат 1-хидроксилаза (S1H), или чрез гентизатния път, използвайки салицилат 5-хидроксилаза (S5H) (Фигура 3). Тъй като салициловата киселина е основният междинен продукт в метаболизма на нафталина (горен път), стъпките от салициловата киселина до междинния продукт TCA често се наричат ​​долния път, а гените са организирани в един оперон. Често се наблюдава, че гените в оперона на горния път (nah) и оперона на долния път (sal) се регулират от общи регулаторни фактори; например, NahR и салициловата киселина действат като индуктори, позволявайки и на двата оперона напълно да метаболизират нафталина (Phale et al., 2019, 2020).
В допълнение, катехолът се разцепва циклично до 2-хидроксимуконат семиалдехид чрез мета пътя от катехол 2,3-диоксигеназа (C23DO) (Yen et al., 1988) и допълнително се хидролизира от 2-хидроксимуконат семиалдехид хидролаза, за да образува 2-хидроксипент-2,4-диенова киселина. След това 2-хидроксипент-2,4-диеноатът се превръща в пируват и ацеталдехид чрез хидратаза (2-оксопент-4-еноат хидратаза) и алдолаза (4-хидрокси-2-оксопентаноат алдолаза) и след това навлиза в централния въглероден път (Фигура 3). Алтернативно, катехолът се разцепва циклично до цис,цис-муконат чрез орто пътя от катехол 1,2-оксигеназа (C12DO). Муконат циклоизомераза, муконолактон изомераза и β-кетоадипат-нолактон хидролаза превръщат цис,цис-муконат в 3-оксоадипат, който навлиза в централния въглероден път чрез сукцинил-CoA и ацетил-CoA (Nozaki et al., 1968) (Фигура 3).
В гентизатния (2,5-дихидроксибензоатен) път, ароматният пръстен се разцепва от гентизат 1,2-диоксигеназа (GDO), за да се образува малеилпируват. Този продукт може да бъде директно хидролизиран до пируват и малат или може да бъде изомеризиран, за да се образува фумарилпируват, който след това може да се хидролизира до пируват и фумарат (Larkin and Day, 1986). Изборът на алтернативния път е наблюдаван както при грам-отрицателни, така и при грам-положителни бактерии на биохимично и генетично ниво (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Грам-отрицателните бактерии (Pseudomonas) предпочитат да използват салицилова киселина, която е индуктор на метаболизма на нафталина, декарбоксилирайки я до катехол, използвайки салицилат 1-хидроксилаза (Gibson and Subramanian, 1984). От друга страна, при Грам-положителните бактерии (Rhodococcus), салицилат 5-хидроксилазата превръща салициловата киселина в гентизинова киселина, докато салициловата киселина няма индуктивен ефект върху транскрипцията на нафталенови гени (Grund et al., 1992) (Фигура 3).
Съобщава се, че видове като Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas и Mycobacterium могат да разграждат монометилнафтален или диметилнафтален (Dean-Raymond and Bartha, 1975; Cane and Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Сред тях, пътят на разграждане на 1-метилнафтален и 2-метилнафтален на Pseudomonas sp. CSV86 е ясно проучен на биохимично и ензимно ниво (Mahajan et al., 1994). 1-Метилнафталенът се метаболизира по два пътя. Първо, ароматният пръстен се хидроксилира (незаместеният пръстен на метилнафталина), за да се образува цис-1,2-дихидрокси-1,2-дихидро-8-метилнафталин, който допълнително се окислява до метилсалицилат и метилкатехол, и след това навлиза в централния въглероден път след разцепване на пръстена (Фигура 3). Този път се нарича „път на източника на въглерод“. Във втория „път на детоксикация“ метиловата група може да бъде хидроксилирана от NDO, за да се образува 1-хидроксиметилнафталин, който допълнително се окислява до 1-нафтоена киселина и се екскретира в културалната среда като продукт без резултат. Проучванията показват, че щам CSV86 не е в състояние да расте върху 1- и 2-нафтоена киселина като единствен източник на въглерод и енергия, което потвърждава неговия път на детоксикация (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). В 2-метилнафталина метиловата група претърпява хидроксилиране от хидроксилаза, за да се образува 2-хидроксиметилнафталин. В допълнение, незаместеният пръстен на нафталиновия пръстен претърпява хидроксилиране на пръстена, за да образува дихидродиол, който се окислява до 4-хидроксиметилкатехол в серия от ензимно-катализирани реакции и навлиза в централния въглероден път чрез пътя на разцепване на мета-пръстена. По подобен начин, съобщава се, че S. paucimobilis 2322 използва NDO за хидроксилане на 2-метилнафтален, който допълнително се окислява до образуване на метилсалицилат и метилкатехол (Dutta et al., 1998).
Нафтоените киселини (заместени/незаместени) са странични продукти от детоксикацията/биотрансформацията, образувани по време на разграждането на метилнафтален, фенантрен и антрацен и освобождавани в използваната хранителна среда. Съобщава се, че почвеният изолат Stenotrophomonas maltophilia CSV89 е способен да метаболизира 1-нафтоена киселина като източник на въглерод (Phale et al., 1995). Метаболизмът започва с дихидроксилиране на ароматния пръстен, за да се образува 1,2-дихидрокси-8-карбоксинафтален. Полученият диол се окислява до катехол чрез 2-хидрокси-3-карбоксибензилиденпируват, 3-формилсалицилова киселина, 2-хидроксиизофталова киселина и салицилова киселина и навлиза в централния въглероден път чрез пътя на разцепване на мета-пръстена (Фигура 3).
Карбарилът е пестицид от групата на нафтил карбамат. След Зелената революция в Индия през 70-те години на миналия век, употребата на химически торове и пестициди е довела до увеличаване на емисиите на полициклични ароматни въглеводороди (ПАВ) от селскостопански неточкови източници (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Около 55% (85 722 000 хектара) от общата обработваема земя в Индия се третира с химически пестициди. През последните пет години (2015–2020 г.) индийският селскостопански сектор е използвал средно от 55 000 до 60 000 тона пестициди годишно (Министерство на кооперациите и благосъстоянието на фермерите, Министерство на земеделието, Правителство на Индия, август 2020 г.). В северните и централните Гангски равнини (щатите с най-голямо население и гъстота на населението) употребата на пестициди върху културите е широко разпространена, като преобладават инсектицидите. Карбарил (1-нафтил-N-метилкарбамат) е широкоспектърен, умерено до силно токсичен карбаматен инсектицид, използван в индийското селско стопанство със средно количество от 100–110 тона. Обикновено се продава под търговското наименование Sevin и се използва за борба с насекоми (листни въшки, огнени мравки, бълхи, акари, паяци и много други вредители на открито), засягащи различни култури (царевица, соя, памук, плодове и зеленчуци). Някои микроорганизми като Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus и Arthrobacter могат да се използват и за борба с други вредители. Съобщава се, че RC100 може да разгражда карбарил (Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Пътят на разграждане на карбарила е обстойно проучен на биохимично, ензимно и генетично ниво в почвени изолати на Pseudomonas sp. Щамове C4, C5 и C6 (Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (фиг. 3). Метаболитният път започва с хидролизата на естерната връзка от карбарил хидролаза (CH), за да се образува 1-нафтол, метиламин и въглероден диоксид. След това 1-нафтолът се превръща в 1,2-дихидроксинафтален от 1-нафтол хидроксилаза (1-NH), който допълнително се метаболизира чрез централния въглероден път чрез салицилат и гентизат. Съобщава се, че някои бактерии, разграждащи карбарил, го метаболизират до салицилова киселина чрез разцепване на катехолния орто пръстен (Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991). Забележително е, че бактериите, разграждащи нафталин, метаболизират салициловата киселина предимно чрез катехол, докато бактериите, разграждащи карбарил, предпочитат да метаболизират салициловата киселина чрез гентизатния път.
Производните на нафталинсулфоновата киселина/дисулфоновата киселина и нафтиламинсулфоновата киселина могат да се използват като междинни продукти в производството на азобагрила, омокрящи агенти, дисперсанти и др. Въпреки че тези съединения имат ниска токсичност за хората, оценките на цитотоксичността показват, че те са летални за риби, дафнии и водорасли (Greim et al., 1994). Съобщава се, че представители на рода Pseudomonas (щамове A3, C22) инициират метаболизъм чрез двойно хидроксилиране на ароматния пръстен, съдържащ сулфоновата киселинна група, за да образуват дихидродиол, който допълнително се превръща в 1,2-дихидроксинафтален чрез спонтанно разцепване на сулфитната група (Brilon et al., 1981). Полученият 1,2-дихидроксинафтален се катаболизира по класическия нафталенов път, т.е. катехоловия или гентизатния път (Фигура 4). Доказано е, че аминонафталенсулфоновата киселина и хидроксинафталенсулфоновата киселина могат да бъдат напълно разградени от смесени бактериални консорциуми с комплементарни катаболни пътища (Nortemann et al., 1986). Доказано е, че един член на консорциума десулфурира аминонафталенсулфоновата киселина или хидроксинафталенсулфоновата киселина чрез 1,2-диоксигениране, докато аминосалицилатът или хидроксисалицилатът се освобождава в хранителната среда като метаболит в задънена улица и впоследствие се поема от други членове на консорциума. Нафталендисулфоновата киселина е относително полярна, но слабо биоразградима и следователно може да се метаболизира по различни пътища. Първата десулфуризация протича по време на региоселективно дихидроксилиране на ароматния пръстен и групата на сулфоновата киселина; втората десулфуризация протича по време на хидроксилиране на 5-сулфосалицилова киселина от салицилова киселина 5-хидроксилаза, за да се образува гентизинова киселина, която навлиза в централния въглероден път (Brilon et al., 1981) (Фигура 4). Ензимите, отговорни за разграждането на нафталина, са отговорни и за метаболизма на нафталин сулфонат (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Фигура 4. Метаболитни пътища за разграждане на нафталин сулфонат. Числата в кръговете представляват ензимите, отговорни за метаболизма на нафтил сулфонат, подобни/идентични на ензимите, описани на Фиг. 3.
Нискомолекулните ПАВ (НМ-ПАВ) са редуцируеми, хидрофобни и слабо разтворими и следователно не са податливи на естествено разграждане/разграждане. Аеробните микроорганизми обаче са способни да ги окисляват чрез абсорбиране на молекулен кислород (O2). Тези ензими принадлежат главно към класа на оксидоредуктазите и могат да извършват различни реакции като хидроксилиране на ароматен пръстен (моно- или дихидроксилиране), дехидрогениране и разцепване на ароматен пръстен. Продуктите, получени от тези реакции, са в по-висока степен на окисление и се метаболизират по-лесно през централния въглероден път (Phale et al., 2020). Съобщава се, че ензимите в пътя на разграждане са индуцируеми. Активността на тези ензими е много ниска или незначителна, когато клетките се отглеждат върху прости въглеродни източници като глюкоза или органични киселини. Таблица 3 обобщава различните ензими (оксигенази, хидролази, дехидрогенази, оксидази и др.), участващи в метаболизма на нафталин и неговите производни.
Таблица 3. Биохимични характеристики на ензимите, отговорни за разграждането на нафталин и неговите производни.
Радиоизотопни изследвания (18O2) показват, че включването на молекулен O2 в ароматните пръстени от оксигеназите е най-важната стъпка за активиране на по-нататъшното биоразграждане на съединението (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Включването на един кислороден атом (O) от молекулен кислород (O2) в субстрата се инициира от ендогенни или екзогенни монооксигенази (наричани още хидроксилази). Друг кислороден атом се редуцира до вода. Екзогенните монооксигенази редуцират флавина с NADH или NADPH, докато при ендомонооксигеназите флавинът се редуцира от субстрата. Позицията на хидроксилиране води до разнообразие в образуването на продукти. Например, салицилат 1-хидроксилазата хидроксилира салицилова киселина в C1 позиция, образувайки катехол. От друга страна, многокомпонентната салицилат 5-хидроксилаза (съдържаща редуктаза, фередоксин и оксигеназа субединици) хидроксилира салицилова киселина в позиция C5, образувайки гентизинова киселина (Yamamoto et al., 1965).
Диоксигеназите включват два O2 атома в субстрата. В зависимост от образуваните продукти, те се разделят на пръстенно хидроксилиращи диоксигенази и пръстенно разцепващи диоксигенази. Пръстенно хидроксилиращите диоксигенази превръщат ароматните субстрати в цис-дихидродиоли (напр. нафталин) и са широко разпространени сред бактериите. Към днешна дата е доказано, че организмите, съдържащи пръстенно хидроксилиращи диоксигенази, са способни да растат върху различни ароматни въглеродни източници и тези ензими са класифицирани като NDO (нафталин), толуен диоксигеназа (TDO, толуен) и бифенил диоксигеназа (BPDO, бифенил). Както NDO, така и BPDO могат да катализират двойното окисление и хидроксилиране на страничната верига на различни полициклични ароматни въглеводороди (толуен, нитротолуен, ксилен, етилбензен, нафтален, бифенил, флуорен, индол, метилнафтален, нафталенсулфонат, фенантрен, антрацен, ацетофенон и др.) (Boyd and Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO е многокомпонентна система, състояща се от оксидоредуктаза, фередоксин и оксигеназен компонент, съдържащ активния център (Gibson and Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). Каталитичната единица на NDO се състои от голяма α субединица и малка β субединица, подредени в α3β3 конфигурация. NDO принадлежи към голямо семейство оксигенази и неговата α-субединица съдържа Rieske сайт [2Fe-2S] и мононуклеарно нехемово желязо, което определя субстратната специфичност на NDO (Parales et al., 1998). Обикновено, в един каталитичен цикъл, два електрона от редукцията на пиридинов нуклеотид се прехвърлят към Fe(II) йона в активния център чрез редуктаза, фередоксин и Rieske сайт. Редуциращите еквиваленти активират молекулен кислород, което е предпоставка за дихидроксилиране на субстрата (Ferraro et al., 2005). Към днешна дата само няколко NDO са пречистени и характеризирани подробно от различни щамове и генетичният контрол на пътищата, участващи в разграждането на нафталина, е проучен подробно (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Диоксигеназите, разцепващи пръстена (ензими, разцепващи орто-пръстена, и екзодиол- или мета-пръстен-разцепващи ензими), действат върху хидроксилирани ароматни съединения. Например, диоксигеназата, разцепваща орто-пръстена, е катехол-1,2-диоксигеназа, докато диоксигеназата, разцепваща мета-пръстена, е катехол-2,3-диоксигеназа (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). В допълнение към различните оксигенази, съществуват и различни дехидрогенази, отговорни за дехидрогенирането на ароматни дихидродиоли, алкохоли и алдехиди, и използващи NAD+/NADP+ като акцептори на електрони, които са едни от важните ензими, участващи в метаболизма (Gibson and Subramanian, 1984; Shaw and Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Ензими като хидролази (естерази, амидази) са втори важен клас ензими, които използват вода за разцепване на ковалентни връзки и проявяват широка субстратна специфичност. Карбарил хидролазата и други хидролази се считат за компоненти на периплазмата (трансмембрана) при членовете на Грам-отрицателните бактерии (Kamini et al., 2018). Карбарилът има както амидна, така и естерна връзка; следователно, той може да бъде хидролизиран от естераза или амидаза, за да образува 1-нафтол. Съобщава се, че карбарилът в щам AC10023 на Rhizobium rhizobium и щам RC100 на Arthrobacter функционира съответно като естераза и амидаза. Карбарилът в щам RC100 на Arthrobacter също функционира като амидаза. Доказано е, че RC100 хидролизира четири инсектицида от клас N-метилкарбамат, като карбарил, метомил, мефенаминова киселина и XMC (Hayaatsu et al., 2001). Съобщава се, че CH в Pseudomonas sp. C5pp може да действа върху карбарил (100% активност) и 1-нафтил ацетат (36% активност), но не и върху 1-нафтилацетат, което показва, че е естераза (Trivedi et al., 2016).
Биохимични изследвания, модели на ензимна регулация и генетичен анализ показват, че гените за разграждане на нафталин се състоят от две индуцируеми регулаторни единици или „оперони“: nah („възходящият път“, превръщащ нафталина в салицилова киселина) и sal („низходящият път“, превръщащ салициловата киселина в централния въглероден път чрез катехол). Салициловата киселина и нейните аналози могат да действат като индуктори (Shamsuzzaman and Barnsley, 1974). В присъствието на глюкоза или органични киселини, оперонът се потиска. Фигура 5 показва пълната генетична организация на разграждането на нафталин (в оперонна форма). Няколко наименувани варианта/форми на гена nah (ndo/pah/dox) са описани и е установено, че имат висока хомология на последователността (90%) сред всички видове Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Гените на възходящия път на нафталин обикновено са подредени в консенсусен ред, както е показано на Фигура 5А. Съобщава се, че друг ген, nahQ, също участва в метаболизма на нафталина и обикновено се намира между nahC и nahE, но действителната му функция остава да бъде изяснена. По подобен начин, генът nahY, отговорен за чувствителната към нафталин хемотаксис, е открит в дисталния край на nah оперона при някои членове. При Ralstonia sp., генът U2, кодиращ глутатион S-трансфераза (gsh), е разположен между nahAa и nahAb, но не повлиява характеристиките на утилизиране на нафталин (Zylstra et al., 1997).
Фигура 5. Генетична организация и разнообразие, наблюдавани по време на разграждането на нафталин сред бактериални видове; (A) Горен нафталинов път, метаболизъм на нафталин до салицилова киселина; (B) Долен нафталинов път, салицилова киселина чрез катехол до централния въглероден път; (C) салицилова киселина чрез гентизат до централния въглероден път.
„Долният път“ (sal оперон) обикновено се състои от nahGTHINLMOKJ и превръща салицилата в пируват и ацеталдехид чрез пътя на разцепване на катехол метаринг. Генът nahG (кодиращ салицилат хидроксилаза) е установен, че е запазен в проксималния край на оперона (фиг. 5B). В сравнение с други щамове, разграждащи нафталин, при P. putida CSV86 nah и sal опероните са тандемни и много тясно свързани (около 7,5 kb). При някои грам-отрицателни бактерии, като Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 и P. putida AK5, нафталинът се метаболизира като централен въглероден метаболит чрез гентизатния път (под формата на sgp/nag оперона). Генната касета обикновено е представена във формата nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, където nagR (кодиращ регулатор от тип LysR) е разположен в горния край (Фигура 5C).
Карбарилът навлиза в централния въглероден цикъл чрез метаболизма на 1-нафтол, 1,2-дихидроксинафтален, салицилова киселина и гентизинова киселина (Фигура 3). Въз основа на генетични и метаболитни изследвания е предложено този път да се раздели на „нагоре по веригата“ (превръщане на карбарил в салицилова киселина), „среден“ (превръщане на салицилова киселина в гентизинова киселина) и „надолу по веригата“ (превръщане на гентизинова киселина в междинни продукти на централния въглероден път) (Singh et al., 2013). Геномният анализ на C5pp (суперконтиг А, 76.3 kb) разкри, че генът mcbACBDEF участва в превръщането на карбарил в салицилова киселина, последван от mcbIJKL в превръщането на салициловата киселина в гентизинова киселина и mcbOQP в превръщането на гентизинова киселина в централни въглеродни междинни продукти (фумарат и пируват, Trivedi et al., 2016) (Фигура 6).
Съобщава се, че ензимите, участващи в разграждането на ароматни въглеводороди (включително нафталин и салицилова киселина), могат да бъдат индуцирани от съответните съединения и инхибирани от прости въглеродни източници като глюкоза или органични киселини (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Сред различните метаболитни пътища на нафталина и неговите производни, регулаторните характеристики на нафталина и карбарила са проучени до известна степен. За нафталина, гените както в горния, така и в низходящия път се регулират от NahR, транс-активиращ положителен регулатор от тип LysR. Той е необходим за индуцирането на nah гена от салицилова киселина и последващата му експресия на високо ниво (Yen and Gunsalus, 1982). Освен това, проучванията показват, че интегративният гостоприемников фактор (IHF) и XylR (сигма 54-зависим транскрипционен регулатор) също са критични за транскрипционното активиране на гени в метаболизма на нафталина (Ramos et al., 1997). Проучвания показват, че ензимите от пътя на отваряне на катехоловия мета-пръстен, а именно катехол 2,3-диоксигеназа, се индуцират в присъствието на нафталин и/или салицилова киселина (Basu et al., 2006). Проучвания показват, че ензимите от пътя на отваряне на катехоловия орто-пръстен, а именно катехол 1,2-диоксигеназа, се индуцират в присъствието на бензоена киселина и цис,цис-муконат (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
В щам C5pp, пет гена, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR и mcbS, кодират регулатори, принадлежащи към семейството транскрипционни регулатори LysR/TetR, отговорни за контрола на разграждането на карбарила. Установено е, че хомоложният ген mcbG е най-тясно свързан с регулатора от тип LysR PhnS (58% идентичност на аминокиселините), участващ в метаболизма на фенантрена в Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Установено е, че генът mcbH участва в междинния път (превръщане на салицилова киселина в гентизинова киселина) и принадлежи към транскрипционния регулатор от тип LysR NagR/DntR/NahR в Pseudomonas и Burkholderia. Съобщава се, че членове на това семейство разпознават салициловата киселина като специфична ефекторна молекула за индуциране на гени за разграждане. От друга страна, три гена, mcbN, mcbR и mcbS, принадлежащи към транскрипционни регулатори тип LysR и TetR, бяха идентифицирани в низходящия път (метаболити на гентизат-централния въглероден път).
При прокариотите, хоризонталните процеси на генен трансфер (придобиване, обмен или трансфер) чрез плазмиди, транспозони, профаги, геномни острови и интегративни конюгативни елементи (ICE) са основни причини за пластичност в бактериалните геноми, водещи до придобиване или загуба на специфични функции/черта. Това позволява на бактериите бързо да се адаптират към различни условия на околната среда, предоставяйки потенциални адаптивни метаболитни предимства на гостоприемника, като например разграждането на ароматни съединения. Метаболитните промени често се постигат чрез фина настройка на опероните за разграждане, техните регулаторни механизми и ензимни специфичности, което улеснява разграждането на по-широк спектър от ароматни съединения (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Установено е, че генните касети за разграждане на нафталин са разположени върху различни мобилни елементи, като плазмиди (конюгативни и неконюгативни), транспозони, геноми, ICE и комбинации от различни бактериални видове (Фигура 5). В Pseudomonas G7, nah и sal опероните на плазмида NAH7 са транскрибирани в една и съща ориентация и са част от дефектен транспозон, който изисква транспозаза Tn4653 за мобилизация (Sota et al., 2006). В щам Pseudomonas NCIB9816-4, генът е открит върху конюгативния плазмид pDTG1 като два оперона (на разстояние приблизително 15 kb един от друг), които са транскрибирани в противоположни посоки (Dennis and Zylstra, 2004). В щам Pseudomonas putida AK5, неконюгативният плазмид pAK5 кодира ензима, отговорен за разграждането на нафталин чрез гентизатния път (Izmalkova et al., 2013). В щам Pseudomonas PMD-1, nah оперонът е разположен върху хромозомата, докато sal оперонът е разположен върху конюгативния плазмид pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Въпреки това, в Pseudomonas stutzeri AN10, всички гени за разграждане на нафталин (nah и sal оперони) са разположени върху хромозомата и вероятно се набират чрез транспозиция, рекомбинация и пренареждане (Bosch et al., 2000). В Pseudomonas sp. CSV86, nah и sal опероните са разположени в генома под формата на ICE (ICECSV86). Структурата е защитена от tRNAGly, последвана от директни повторения, показващи места за рекомбинация/прикрепване (attR и attL) и фагоподобна интеграза, разположена в двата края на tRNAGly, като по този начин структурно подобна на ICEclc елемента (ICEclcB13 в Pseudomonas knackmusii за разграждане на хлорокатехол). Съобщава се, че гените върху ICE могат да бъдат прехвърлени чрез конюгация с изключително ниска честота на трансфер (10-8), като по този начин се прехвърлят свойствата на разграждане на реципиента (Basu and Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Повечето от гените, отговорни за разграждането на карбарила, са разположени върху плазмиди. Arthrobacter sp. RC100 съдържа три плазмида (pRC1, pRC2 и pRC300), от които два конюгиращи плазмида, pRC1 и pRC2, кодират ензимите, които превръщат карбарила в гентизат. От друга страна, ензимите, участващи в превръщането на гентизата в централните въглеродни метаболити, са разположени върху хромозомата (Hayaatsu et al., 1999). Бактериите от рода Rhizobium. Щам AC100, използван за превръщането на карбарила в 1-нафтол, съдържа плазмид pAC200, който носи гена cehA, кодиращ CH, като част от Tnceh транспозона, заобиколен от последователности, подобни на инсерционни елементи (istA и istB) (Hashimoto et al., 2002). В щам CF06 на Sphingomonas, генът за разграждане на карбарил се смята, че присъства в пет плазмида: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 и pCF05. ДНК хомологията на тези плазмиди е висока, което показва съществуването на генно дупликационно събитие (Feng et al., 1997). В симбионт, разграждащ карбарил, съставен от два вида Pseudomonas, щам 50581 съдържа конюгативен плазмид pCD1 (50 kb), кодиращ гена за mcd карбарил хидролаза, докато конюгативен плазмид в щам 50552 кодира ензим, разграждащ 1-нафтол (Chapalamadugu and Chaudhry, 1991). В щам WM111 на Achromobacter, генът за mcd furadan хидролаза е разположен върху плазмид от 100 kb (pPDL11). Доказано е, че този ген присъства в различни плазмиди (100, 105, 115 или 124 kb) в различни бактерии от различни географски региони (Parekh et al., 1995). В Pseudomonas sp. C5pp, всички гени, отговорни за разграждането на карбарила, са разположени в геном, обхващащ 76,3 kb последователност (Trivedi et al., 2016). Геномният анализ (6,15 Mb) разкри наличието на 42 MGE и 36 GEI, от които 17 MGE са разположени в суперконтиг A (76,3 kb) със средно асиметрично съдържание на G+C (54–60 mol%), което предполага възможни хоризонтални събития на генен трансфер (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 показва подобно разположение на гени, разграждащи карбарила, но тези гени са разположени върху плазмид (Zhu et al., 2019).
В допълнение към метаболитната ефективност на биохимично и геномно ниво, микроорганизмите проявяват и други свойства или реакции, като хемотаксис, свойства за модификация на клетъчната повърхност, компартментализация, преференциално използване, производство на биосърфактанти и др., които им помагат да метаболизират по-ефективно ароматните замърсители в замърсена среда (Фигура 7).
Фигура 7. Различни стратегии за клетъчен отговор на идеални бактерии, разграждащи ароматни въглеводороди, за ефективно биоразграждане на чужди замърсители.
Хемотактичните реакции се считат за фактори, усилващи разграждането на органични замърсители в хетерогенно замърсени екосистеми. (2002) демонстрира, че хемотаксисът на Pseudomonas sp. G7 към нафталин увеличава скоростта на разграждане на нафталина във водните системи. Дивият тип щам G7 разгражда нафталина много по-бързо от мутантния щам с дефицит на хемотаксис. Установено е, че NahY протеинът (538 аминокиселини с мембранна топология) е ко-транскрибиран с гените на пътя на метаразцепване на плазмида NAH7 и подобно на хемотаксичните преобразуватели, този протеин изглежда функционира като хеморецептор за разграждане на нафталина (Grimm and Harwood 1997). Друго проучване на Hansel et al. (2009) показва, че протеинът е хемотактичен, но скоростта му на разграждане е висока. (2011) демонстрират хемотактичен отговор на Pseudomonas (P. putida) към газообразен нафталин, при който дифузията в газова фаза води до постоянен поток от нафталин към клетките, което контролира хемотактичния отговор на клетките. Изследователите са използвали това хемотактично поведение, за да създадат микроби, които биха ускорили скоростта на разграждане. Проучванията показват, че хемосензорните пътища регулират и други клетъчни функции, като клетъчно делене, регулиране на клетъчния цикъл и образуване на биофилм, като по този начин спомагат за контролиране на скоростта на разграждане. Използването на това свойство (хемотаксис) за ефективно разграждане обаче е възпрепятствано от няколко пречки. Основните пречки са: (а) различни паралогични рецептори разпознават едни и същи съединения/лиганди; (б) съществуване на алтернативни рецептори, т.е. енергиен тропизъм; (в) значителни разлики в последователностите в сензорните домейни на едно и също рецепторно семейство; и (г) липса на информация за основните бактериални сензорни протеини (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Понякога биоразграждането на ароматни въглеводороди произвежда множество метаболити/междинни продукти, които могат да бъдат хемотактични за една група бактерии, но отблъскващи за други, което допълнително усложнява процеса. За да идентифицираме взаимодействията на лиганди (ароматни въглеводороди) с химични рецептори, ние конструирахме хибридни сензорни протеини (PcaY, McfR и NahY) чрез сливане на сензорните и сигналните домейни на Pseudomonas putida и Escherichia coli, които са насочени към рецепторите за ароматни киселини, TCA междинни продукти и нафталин, съответно (Luu et al., 2019).
Под влияние на нафталин и други полициклични ароматни въглеводороди (ПАВ), структурата на бактериалната мембрана и целостта на микроорганизмите претърпяват значителни промени. Проучванията показват, че нафталинът пречи на взаимодействието на ацилната верига чрез хидрофобни взаимодействия, като по този начин увеличава набъбването и флуидността на мембраната (Sikkema et al., 1995). За да противодействат на този вреден ефект, бактериите регулират флуидността на мембраната, като променят съотношението и състава на мастните киселини между изо/антеизо разклонено-верижните мастни киселини и изомеризират цис-ненаситените мастни киселини в съответните транс-изомери (Heipieper and de Bont, 1994). В Pseudomonas stutzeri, отглеждан при третиране с нафталин, съотношението на наситените към ненаситените мастни киселини се е увеличило от 1,1 на 2,1, докато в Pseudomonas JS150 това съотношение се е увеличило от 7,5 на 12,0 (Mrozik et al., 2004). Когато се отглеждат върху нафталин, клетките Achromobacter KAs 3–5 показват клетъчна агрегация около нафталинови кристали и намаляване на повърхностния заряд на клетките (от -22,5 до -2,5 mV), придружено от цитоплазмена кондензация и вакуолизация, което показва промени в клетъчната структура и свойствата на клетъчната повърхност (Mohapatra et al., 2019). Въпреки че клетъчните/повърхностните промени са пряко свързани с по-добро усвояване на ароматни замърсители, съответните биоинженерни стратегии не са напълно оптимизирани. Манипулирането на клетъчната форма рядко се използва за оптимизиране на биологичните процеси (Volke and Nikel, 2018). Делецията на гени, засягащи клетъчното делене, причинява промени в клетъчната морфология. Делецията на гени, засягащи клетъчното делене, причинява промени в клетъчната морфология. При Bacillus subtilis е доказано, че протеинът на клетъчната преграда SepF участва във формирането на преградата и е необходим за следващите стъпки на клетъчното делене, но не е есенциален ген. Делецията на гени, кодиращи пептидни гликанови хидролази в Bacillus subtilis, води до удължаване на клетките, повишена специфична скорост на растеж и подобрен капацитет за производство на ензими (Cui et al., 2018).
Предложена е компартментализация на пътя на разграждане на карбарила, за да се постигне ефективно разграждане на щамовете на Pseudomonas C5pp и C7 (Kamini et al., 2018). Предполага се, че карбарилът се транспортира в периплазменото пространство през външната мембранна преграда и/или чрез дифузионни порини. CH е периплазмен ензим, който катализира хидролизата на карбарила до 1-нафтол, който е по-стабилен, по-хидрофобен и по-токсичен. CH е локализиран в периплазмата и има нисък афинитет към карбарила, като по този начин контролира образуването на 1-нафтол, предотвратявайки натрупването му в клетките и намалявайки токсичността му за клетките (Kamini et al., 2018). Полученият 1-нафтол се транспортира в цитоплазмата през вътрешната мембрана чрез разделяне и/или дифузия и след това се хидроксилира до 1,2-дихидроксинафтален от високоафинитетния ензим 1NH за по-нататъшен метаболизъм в централния въглероден път.
Въпреки че микроорганизмите имат генетичните и метаболитни способности да разграждат ксенобиотични въглеродни източници, йерархичната структура на тяхното използване (т.е. преференциално използване на прости пред сложни въглеродни източници) е основна пречка за биоразграждането. Наличието и използването на прости въглеродни източници понижава гените, кодиращи ензими, които разграждат сложни/непредпочитани въглеродни източници, като например полициклични ароматни въглеводороди (ПАВ). Добре проучен пример е, че когато глюкоза и лактоза се подават едновременно на Escherichia coli, глюкозата се използва по-ефективно от лактозата (Jacob and Monod, 1965). Съобщава се, че Pseudomonas разгражда различни ПАВ и ксенобиотични съединения като източници на въглерод. Йерархията на използване на въглеродните източници при Pseudomonas е органични киселини > глюкоза > ароматни съединения (Hylemon and Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Има обаче изключение. Интересното е, че Pseudomonas sp. CSV86 показва уникална йерархична структура, която преференциално използва ароматни въглеводороди (бензоена киселина, нафталин и др.), а не глюкоза, и кометаболизира ароматните въглеводороди с органични киселини (Basu et al., 2006). При тази бактерия гените за разграждане и транспорт на ароматни въглеводороди не са потиснати дори при наличие на втори източник на въглерод, като глюкоза или органични киселини. При отглеждане в среда от глюкоза и ароматни въглеводороди е наблюдавано, че гените за транспорт и метаболизъм на глюкозата са потиснати, ароматните въглеводороди са използвани в първата логаритмична фаза, а глюкозата е използвана във втората логаритмична фаза (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). От друга страна, наличието на органични киселини не е повлияло на експресията на метаболизма на ароматните въглеводороди, така че се очаква тази бактерия да бъде кандидат щам за изследвания за биоразграждане (Phale et al., 2020).
Добре известно е, че биотрансформацията на въглеводородите може да причини оксидативен стрес и повишена регулация на антиоксидантните ензими в микроорганизмите. Неефективното биоразграждане на нафталина както в клетки в стационарна фаза, така и в присъствието на токсични съединения води до образуването на реактивни кислородни видове (ROS) (Kang et al. 2006). Тъй като ензимите, разграждащи нафталина, съдържат желязо-серни клъстери, под оксидативен стрес желязото в хема и желязо-серните протеини ще се окисли, което ще доведе до инактивиране на протеините. Фередоксин-NADP+ редуктазата (Fpr), заедно със супероксид дисмутаза (SOD), медиира обратимата редокс реакция между NADP+/NADPH и две молекули фередоксин или флаводоксин, като по този начин улавя ROS и възстановява желязо-серния център под оксидативен стрес (Li et al. 2006). Съобщава се, че както Fpr, така и SodA (SOD) в Pseudomonas могат да бъдат индуцирани от оксидативен стрес, а повишена SOD и каталазна активност е наблюдавана в четири щама Pseudomonas (O1, W1, As1 и G1) по време на растеж при условия на добавяне на нафталин (Kang et al., 2006). Проучвания показват, че добавянето на антиоксиданти като аскорбинова киселина или двувалентно желязо (Fe2+) може да увеличи скоростта на растеж на нафталин. Когато Rhodococcus erythropolis расте в нафталинова среда, транскрипцията на свързаните с оксидативния стрес цитохром P450 гени, включително sodA (Fe/Mn супероксид дисмутаза), sodC (Cu/Zn супероксид дисмутаза) и recA, е била повишена (Sazykin et al., 2019). Сравнителен количествен протеомен анализ на клетки Pseudomonas, култивирани в нафталин, показва, че повишената регулация на различни протеини, свързани с реакцията на оксидативен стрес, е стратегия за справяне със стреса (Herbst et al., 2013).
Съобщава се, че микроорганизмите произвеждат биоповърхностноактивни вещества под действието на хидрофобни въглеродни източници. Тези повърхностноактивни вещества са амфифилни повърхностноактивни съединения, които могат да образуват агрегати на границите масло-вода или въздух-вода. Това насърчава псевдо-разтварянето и улеснява адсорбцията на ароматни въглеводороди, което води до ефективно биоразграждане (Rahman et al., 2002). Поради тези свойства, биоповърхностноактивните вещества се използват широко в различни индустрии. Добавянето на химични повърхностноактивни вещества или биоповърхностноактивни вещества към бактериални култури може да повиши ефективността и скоростта на разграждане на въглеводородите. Сред биоповърхностноактивните вещества, рамнолипидите, произведени от Pseudomonas aeruginosa, са обстойно проучени и характеризирани (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Освен това, други видове биоповърхностноактивни вещества включват липопептиди (муцини от Pseudomonas fluorescens), емулгатор 378 (от Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg and Ron, 1999), трехалозни дизахаридни липиди от Rhodococcus (Ramdahl, 1985), лихенин от Bacillus (Saraswathy and Hallberg, 2002) и повърхностноактивно вещество от Bacillus subtilis (Siegmund and Wagner, 1991) и Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Доказано е, че тези мощни повърхностноактивни вещества намаляват повърхностното напрежение от 72 дина/см до по-малко от 30 дина/см, което позволява по-добра абсорбция на въглеводороди. Съобщава се, че Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia и други бактериални видове могат да произвеждат различни биосърфактанти на базата на рамнолипиди и гликолипиди, когато се отглеждат в нафталинова и метилнафталинова среда (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 може да произвежда извънклетъчен биосърфактант Biosur-Pm, когато се отглежда върху ароматни съединения като нафтоена киселина (Phale et al., 1995). Кинетиката на образуване на Biosur-Pm показва, че неговият синтез е процес, зависим от растежа и pH. Установено е, че количеството Biosur-Pm, произведено от клетки при неутрално pH, е по-високо, отколкото при pH 8,5. Клетките, отглеждани при pH 8,5, са по-хидрофобни и имат по-висок афинитет към ароматни и алифатни съединения, отколкото клетките, отглеждани при pH 7,0. В Rhodococcus spp. N6, по-високото съотношение въглерод към азот (C:N) и ограничението на желязото са оптимални условия за производството на извънклетъчни биоповърхностноактивни вещества (Mutalik et al., 2008). Правени са опити за подобряване на биосинтеза на биоповърхностноактивни вещества (повърхностноактивни вещества) чрез оптимизиране на щамовете и ферментацията. Титърът на повърхностноактивното вещество в културалната среда обаче е нисък (1,0 g/L), което представлява предизвикателство за мащабно производство (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Поради това са използвани методи на генно инженерство за подобряване на биосинтеза му. Инженерната му модификация обаче е трудна поради големия размер на оперона (∼25 kb) и сложната биосинтетична регулация на кворум сензорната система (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Редица генно-инженерни модификации са извършени в бактерии Bacillus, насочени главно към увеличаване на производството на повърхностноактивен сърфактин чрез заместване на промотора (srfA оперон), свръхекспресиране на експортния протеин на повърхностноактивен сърфактин YerP и регулаторните фактори ComX и PhrC (Jiao et al., 2017). Тези генно-инженерни методи обаче са постигнали само една или няколко генетични модификации и все още не са достигнали търговско производство. Следователно е необходимо по-нататъшно проучване на методите за оптимизация, базирани на знания.
Проучванията за биоразграждане на PAH се провеждат главно при стандартни лабораторни условия. Въпреки това, на замърсени места или в замърсена среда е доказано, че много абиотични и биотични фактори (температура, pH, кислород, наличност на хранителни вещества, бионаличност на субстрата, други ксенобиотици, инхибиране на крайните продукти и др.) променят и влияят върху разграждащия капацитет на микроорганизмите.
Температурата има значително влияние върху биоразграждането на ПАВ. С повишаване на температурата концентрацията на разтворен кислород намалява, което влияе върху метаболизма на аеробните микроорганизми, тъй като те се нуждаят от молекулен кислород като един от субстратите за оксигеназите, които извършват реакции на хидроксилиране или разкъсване на пръстена. Често се отбелязва, че повишената температура превръща изходните ПАВ в по-токсични съединения, като по този начин инхибира биоразграждането (Muller et al., 1998).
Беше отбелязано, че много замърсени с полициклични ароматни въглеводороди места имат екстремни стойности на pH, като например замърсени с киселинни минни дренажи места (pH 1–4) и места за газификация на природен газ/въглища, замърсени с алкален инфилтрат (pH 8–12). Тези условия могат сериозно да повлияят на процеса на биоразграждане. Следователно, преди да се използват микроорганизми за биоремедиация, се препоръчва да се регулира pH чрез добавяне на подходящи химикали (с умерен до много нисък окислително-редукционен потенциал), като амониев сулфат или амониев нитрат за алкални почви или варуване с калциев карбонат или магнезиев карбонат за киселинни места (Bowlen et al. 1995; Gupta and Sar 2020).
Доставянето на кислород в засегнатата зона е фактор, ограничаващ скоростта на биоразграждане на PAH. Поради редокс условията на околната среда, процесите на in situ биоремедиация обикновено изискват въвеждане на кислород от външни източници (обработка, въздушно барботиране и добавяне на химикали) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) демонстрират, че добавянето на магнезиев пероксид (съединение, освобождаващо кислород) към замърсен водоносен хоризонт може ефективно да биоремедиира BTEX съединения. Друго проучване изследва in situ разграждането на фенол и BTEX в замърсен водоносен хоризонт чрез инжектиране на натриев нитрат и изграждане на екстракционни кладенци за постигане на ефективна биоремедиация (Bewley and Webb, 2001).