Настояще†Настоящ адрес: OX11 0DE, Великобритания, сграда Diamond, научен и иновационен парк Harwell, Диеткот, Оксфордшир, Великобритания, Diamond Light Source Co., Ltd., Център за електронно биологично изобразяване.
Реакционният център, събиращ светлина, е основният фотосинтетичен компонент на пурпурните фототрофни бактерии. Представихме две крио-електронно-микроскопски структури на RC-LH1 комплекса от Rhodopseudomonas palustris. Структурата с резолюция 2.65 Å на RC-LH114-W комплекса се състои от 14 субединични LH1 бримки, обграждащи RC, която е прекъсната от протеин W, докато комплексът без протеин W е изцяло RC състав, обграден от RC. Затворена LH1 бримка от 16 субединици. Сравнението на тези структури дава представа за динамиката на хинона в RC-LH1 комплекса, включително неопределени досега конформационни промени при свързване на хинон в QB мястото на RC, както и местоположението на спомагателните места за свързване на хинон, които помагат за преминаването им към RC. Уникалната структура на W протеина предотвратява затварянето на LH1 бримката, като по този начин създава канал за ускоряване на обмена хинон/хинолон.
Енергията, осигурена от фотосинтезата, може да поддържа почти целия живот на земята и има голям потенциал за слънчевата биотехнология. Освен че насърчават глобалната фотосинтеза, лилавите фототрофни бактерии проявяват и различни енергийни режими и метаболитни способности. Те могат да избягват фотосинтезата и да растат като хетеротрофни бактерии на тъмно, могат да фиксират азот и въглероден диоксид, да произвеждат водород и да разграждат ароматни съединения (1-3). За да се осигури енергия за тези процеси, светлината трябва бързо и ефективно да се преобразува в химическа енергия. Този процес започва, когато антенният комплекс, улавящ светлината, абсорбира светлината и прехвърля заловената енергия към реакционния център (RC), като по този начин започва разделянето на заряда (4-7). Основната единица на фотосинтезата в лилавите фототрофни бактерии е съставена от RC тип 2, заобиколен от светлосъбиращ комплекс 1 (LH1), образуващ основния комплекс RC-LH1. LH1 се образува от масив от извити αβ хетеродимери, всеки от които свързва две бактериални молекули хлорофил (BChl) a и един или два каротеноида (8-12). Най-простата LH1 антена се състои от 16 или 17 αβ хетеродимера, обграждащи RC (9-13) в затворен контур, но в други основни комплекси, трансмембранните пептиди прекъсват непрекъснатостта на обграждащия LH1, като по този начин насърчават дифузията на хинол/хинон между RC и цитохром bc1 комплекса (11, 13-15). Лилавото фототрофно растение Rhodopseudomonas (Rps.) е моделен организъм, който може да разбере енергийния и електронен трансфер, който поддържа фотосинтезата. Първата кристална структура на Rps. Моделът на palustris RC-LH1 комплекса е RC, заобиколен от 15 хетеродимерни LH1 контура, които са прекъснати от неизвестен протеин, наречен „Protein W“ (14). Protein-W впоследствие е идентифициран като RPA4402, който е нехарактеризиран 10.5kDa протеин с три предсказани трансмембранни спирали (TMH) (16). Предлагаме да преименуваме гена rpa4402, кодиращ протеин W, на pufW, за да бъде в съответствие с номенклатурата, използвана за гени, кодиращи RC-L, M (pufL, pufM) и LH1α, β (pufA, pufB) субединици. Интересното е, че протеин-W присъства само в около 10% от RC-LH1, което разкрива, че Rps. palustris произвежда два различни RC-LH1 комплекса. Тук представяме крио-ЕМ (cryo-EM) структури с висока резолюция на два основни комплекса, единият с протеин W и 14 αβ хетеродимера, другият без протеин W и затворена 16-хетеродимерна LH1 бримка. Нашата структура представлява стъпка в разбирането на RC-LH1 комплекса на Rps. palustris, тъй като сме анализирали хомогенната популация на всеки вариант и имаме достатъчна резолюция, за да определим ясно всеки пептид и свързаните пигменти и свързаните липиди и хинони. Сравнението на тези структури показва, че трите TMH протеина-W, които досега не са открити в никой друг RC-LH1 комплекс, генерират хинонов канал за ускоряване на обмена хинон/хинолон. Идентифицирани са редица консервирани места за свързване на липиди и хинони и ние разкрихме нова конформационна промяна след комбинацията от хинон и RC, която може да е подходяща за RC на фотосистема II (PSII) на оксигенирани фототрофни организми. Нашите открития предоставят нова информация за кинетиката на свързването и обмена хинон/хинолон в основния комплекс RC-LH1 на пурпурни фототрофни бактерии.
За да улесним подробното проучване на двата комплекса, открити в Rps. palustris, ние изолираме всеки RC-LH1 чрез биохимични методи. Комплексът с дефицит на протеин W (наричан по-долу ΔpufW) беше пречистен от щама, на който липсва генът pufW (16), и може да бъде произведен само един RC-LH1 комплекс. Комплексът, съдържащ протеин W, се произвежда от щам. Протеинът W на този щам е модифициран с 10x His таг в своя C-край, така че комплексът, съдържащ протеин W, може да бъде ефективно комбиниран с най-липсващия протеин W чрез имобилизиране на метал. Комплексът е ефективно разделен (16) чрез афинитетна хроматография (IMAC).
Както е показано на Фигура 1, и двата комплекса съдържат RC с три подединици (RC-L, RC-M и RC-H), заобиколени от LH1 антена. 2.80-Å структурата на комплекса, лишен от протеин-W, показва 16 αβ хетеродимера, образуващи затворена LH1 бримка, напълно обграждаща RC, наричан по-долу RC-LH116 комплекс. 2.65Å структурата на комплекса, съдържащ протеин-W, има 14-хетеродимер LH1, прекъснат от протеин-W, наричан по-долу RC-LH114-W.
(A и B) Повърхностно представяне на съединението. (C и D) Свързани пигменти, експресирани в пръчици. (E и F) Комплексите, наблюдавани от цитоплазмената повърхност, имат пептидите и LH1 субединиците, представени в карикатури, и са номерирани по часовниковата стрелка от протеин-W празнината [в съответствие с Rba номерирането. sphaeroides комплекс (13)]. За LH1-α, цветът на протеиновата субединица е жълт; за LH1-β, цветът на протеиновата субединица е син; за протеин-W, протеинът е червен; за RC-H, той е циан; за RC-L, той е оранжев; за RC-M, магента. Кофакторите са представени с пръчици, зеленото представлява молекулите BChl и BPh a, лилавото представлява каротеноидите, а жълтото представлява молекулите UQ10. (G и H) Увеличен изглед на протеин-W празнината в еквивалентната област на RC-LH114-W комплекса (G) и RC-LH116 комплекса (H). Кофакторите са показани под формата на запълване на пространството, хелатният хинон е показан в синьо. Пропастта протеин-W е маркирана със синя пунктирана линия в (G), а малките дупки, където хинон/хинолол дифундира върху LH116 пръстена, са маркирани с черна пунктирана линия в (H).
Фигура 1 (A и B) показва RC, заобиколен от отворени или затворени масиви от LH1αβ хетеродимери, всеки от които свързва два BChl и един каротеноид (Фигура 1, C и D). Предишни проучвания показват, че Rps е LH1 комплексът. В биосинтетичния път на спирулина ксантин, тези видове съдържат смесени популации от каротеноиди (17). Спиропироксантинът обаче е доминиращият каротеноид и неговата плътност е задоволителна. Следователно, ние избрахме да моделираме спироксантин във всички места на свързване на LH1. Алфа и бета полипептидите са единични TMH с къси мембранни външни области (Фигура 1, A, B, E и F). Въпреки че плътността от 17 остатъка в C-края не е наблюдавана, алфа полипептидът е разцепен от Met1 до Ala46 и в двата комплекса. β полипептидът е редуциран от Gly4 до Tyr52 в RC-LH116 и от Ser5 до Tyr52 в RC-LH114-W. Не е наблюдавана плътност от 3 или 4 N-терминални или 13 C-терминални остатъка (Фигура S1). Масспектрометричният анализ на смесения RC-LH1 комплекс, приготвен от щам от див тип, показа, че липсващата област е резултат от хетероложно разцепване на тези пептиди (Фигура S1 и S2). Наблюдавано е и N-терминално формилиране на α-Met1 (f). Анализът показа, че α-пептидът се състои от остатъци от fMet1 до Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, а β-пептидът се състои от остатъци от Ser2 до Ala53, което е в добро съответствие с картата на плътността при ниски температури (EM).
Координацията на α-His29 и β-His36 поставя BChls лице в лице; всеки αβ хетеродимер се сглобява със своите съседи, за да образува отворен контур (RC-LH114-W) или затворен контур (RC-LH116) около RC екситонно-свързания пигментен масив (Фигура 1, C и D). В сравнение с лентата от 877 nm на RC-LH114-W, абсорбционното червено отместване на RC-LH116 при 880 nm е 3 nm (Фигура 2A). Спектърът на кръговия дихроизъм обаче е почти същият (Фигура 2B), което показва, че въпреки че има ясна разлика между отворените и затворените контури, локалната среда на BChls е много сходна. Абсорбционното червено отместване може да е резултат от намалено термично движение и повишена стабилност в затворения контур (18, 19), промяната в пигментното свързване, причинена от затворения контур (20, 21), или комбинация от тези два ефекта (11).
(A) Ултравиолетов/видим/близък инфрачервен абсорбционен спектър, чиито пикове са маркирани със съответните им пигменти и нормализирани спрямо пика на BPh при 775 nm. (B) Спектър на кръгов дихроизъм, нормализиран спрямо абсорбцията на BChl при 805 nm. (C и D) Избрани ΔA спектри от времево разрешените абсорбционни спектри на RC-LH114-W комплекс (C) и RC-LH116 комплекс (D). За по-добра сравнимост, всички спектри са нормализирани спрямо ∆A от −A при 0.2 ps. (E) Скоростта на окисление на цитохром c2 след облъчване в присъствието на различни концентрации на UQ2 (вижте Фигура S8 за суровите данни). (F) В клетки, отглеждани при светлина с нисък, среден или висок интензитет (съответно 10, 30 или 300μMm-2 s-1), протеиновите W и RC-L субединици в пречистения комплекс и съотношението на отделените мембрани. Определете нивото на протеина чрез SDS-полиакриламидна гел електрофореза и имуноанализ (вижте Фигура S9 за суровите данни). Определете съотношението спрямо пречистения RC-LH114-W комплекс. Стехиометричното съотношение на RC-L към протеин-W на комплекса е 1:1.
BChl в позиция 1 в деформираната αβ14 бримка на RC-LH114-W (Фигура 1, A, C и E) са по-близо до първичния донор на RC (P) с 6,8 Å, отколкото еквивалентните BChl в RC-LH116 (Фигура 1, B, D и F, и Фигура S3); обаче, кинетиката на преходна абсорбция на двата комплекса показва, че за RC-LH114-W и RC-LH116, времевите константи за пренос на енергия на възбуждане от LH1 към RC са 40 ± 4 и 44 ± 3 ps (Фигура 2). , C и D, Фигура S4 и Таблица S2). Също така няма съществена разлика в електронния пренос в рамките на RC (Фигура S5 и свързан допълнителен текст). Предполагаме, че близкото съответствие на времето за пренос на енергия между LH1 и RC-P се дължи на сходното разстояние, ъгъл и потенциална енергия на повечето BChl в двете LH1 бримки. Изглежда, че изследването на енергийния модел на LH1 за достигане на минималното разстояние не е по-бързо от директния пренос на енергия от неоптимални места към RC. Отворената LH1 верига в RC-LH114-W може също да претърпи незначително термично движение при условия на ниска температура за структурен анализ и има по-дълга αβ14 пръстенна конформация при стайна температура от пигментационното разстояние на βBChls в позицията на RC1.
Комплексът RC-LH116 съдържа 32 BChl и 16 каротеноида, а цялостната му подредба е същата като тази, получена от Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), щам Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) и зелени водорасли (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). След подравняване са наблюдавани само малки отклонения в позициите на αβ хетеродимерите, особено 1-5, 15 и 16 (Фигура S6). Наличието на протеин-W има значително влияние върху структурата на LH1. Неговите три TMH са свързани чрез къси бримки, като N-терминалът е от страната на лумена на комплекса, а C-терминалът е от цитоплазмената страна (Фигури 1A и 3, A до D). Протеин-W е до голяма степен хидрофобен (Фигура 3B), а TMH2 и TMH3 взаимодействат с LH1αβ-14, за да образуват трансмембранна повърхност (Фигура 3, B и E до G). Интерфейсът е съставен главно от остатъци от Phe, Leu и Val в трансмембранната област. Тези остатъци са подредени с хидрофобни аминокиселини и αβ-14 пигменти. Някои полярни остатъци също допринасят за взаимодействието, включително водородната връзка между W-Thr68 и β-Trp42 на повърхността на комплексната кухина (Фигура 3, F и G). На повърхността на цитоплазмата, Gln34 е в съседство с кето групата на αβ-14 каротеноидите. Освен това, молекулата на n-додецил β-d-малтозид (β-DDM) е разделена и нейната хидрофобна опашка се простира до интерфейса между протеин-W и αβ-14, а липидната опашка може да се намира в тялото. Забелязахме също, че C-терминалните региони на разделяне на протеин W и RCH са много близки, но не са в обхвата на образуване на специфични взаимодействия (Фигура 1, A и E). Възможно е обаче да има взаимодействия в неразделените C-терминални аминокиселини на тези два протеина, което може да осигури механизъм за набиране на протеин-W по време на сглобяването на RC-LH114-W комплекса.
(A) Протеин-W, който е обърнат към интерфейса с LH1αβ14 в анимационната форма, има пръчковидна странична верига (червена), показана в част от диаграмата на електростатичния потенциал (прозрачна сива повърхност с ниво на контура 0,13). (B) Протеин-W, представен от хидрофобно оцветена повърхност. Полярните и заредените области са показани в циан, хидрофобните области са показани в бяло, а силно хидрофобните области са показани в оранжево. (C и D) Протеин-W, представен анимационно, като ориентацията му е същата като в (A) (C) и е завъртян на 180° (D). Според позицията в последователността, различимите остатъци приемат дъгова цветова схема, където N-терминалът е син, а C-терминалът е червен. (E) Протеин-W в същия изглед като в (A), а остатъците на интерфейса протеин-W:LH1 са представени от пръчки с прикрепени маркировки. (F) Протеин-W е завъртян на 90° спрямо (E) и LH1αβ14 в анимационното изображение и спрямо остатъците на интерфейса в стълбчестото изображение. Надвисналите остатъци от бета полипептида са обозначени. Кофакторът е показан като лента, съответстваща на цвета на Фигура 1, разграденият β-DDM е показан в сиво, а кислородът е показан в червено. (G) Изгледът в (F) е завъртян на 180°, с видни остатъци от обозначения алфа полипептид.
Протеин-W замества αβ хетеродимер (15-ия на Фигура 1F), като по този начин предотвратява затварянето на бримката и накланянето на първите три αβ хетеродимера. Наблюдавано е, че максималният ъгъл на наклон на първия αβ-1 хетеродимер спрямо нормалата на филма е от 25° до 29° (Фигура 1, A и E), което се образува от наклона от 2° до 8° на αβ-1 в RC A, остър контраст - LH116 (Фигура 1, B и F). Вторият и третият хетеродимер са наклонени съответно от 12° до 22° и от 5° до 10°. Поради стеричното препятствие на RC, наклонът на αβ-1 не включва втората двойка αβ (която съответства на 16-ия αβ на Фигура 1F), като по този начин се образува ясна празнина в LH1 пръстена (Фигура 1, A и E). Поради липсата на два αβ хетеродимера, съпроводена със загуба на четири BChl и два каротеноида, нито един от каротеноидите не се свързва с усуканата αβ-1 субединица, което води до LH114-W пръстен, съдържащ 13 каротеноида Vegetarian и 28 BChl. Локалните оценки на разделителната способност на двата комплекса в αβ1 до 7 регионите са по-ниски от тези на останалата част от LH1 бримката, което може да отразява присъщата пластичност на LH1 субединицата в съседство с RC QB сайта (Фигура 4).
Снимките на RC-LH114-W (A и B) и RC-LH116 (C и D) са показани от същия изглед отгоре/страничен изглед (A и B) (A и C) и повърхността на кухината от Фиг. 1 (B и D). Цветните клавиши са показани отдясно.
Единственият друг характерен ядрен комплекс със стехиометрично съотношение 1:14 е димерът Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Протеинът W и PufX обаче нямат очевидна хомология и имат значително влияние върху съответните им LH1 структури. PufX е единичен TMH с N-терминален цитоплазмен домен, който взаимодейства с цитоплазмената страна на RC-H субединицата (13) на позиция, съответстваща на Rps. palustris LH116αβ-16. PufX създава канал за обмена хинон/хинолон между RC-LH1 и цитохром bcl комплекса и присъства във всички основни комплекси на Rba. sphaeroides (13). Въпреки че интерфейсът мономер-мономер е в Rba. Димерът sphaeroides RC-LH1-PufX е разположен в позицията на свързване на протеин W в RC-LH114-W, а празнината, индуцирана от PufX и протеин-W, е на еквивалентна позиция (Фигура S7A). Пропастта в RC-LH114-W също е подравнена с хипотетичния хинонов канал (8) на Pseudomonas rosea LH1, който се образува от пептиди, които не са свързани с протеин W или PufX (Фигура S7B). В допълнение, хиноновият канал в Blc. Изумруденозеленият LH1, образуван чрез изключване на една γ субединица (7), е разположен на подобна позиция (Фигура S7C). Въпреки че е медиирана от различни протеини, появата на тези хинонови/хинололови канали в обща позиция в RC-LH1 комплекса изглежда е пример за конвергентна еволюция, което показва, че празнината, създадена от протеин W, може да действа като хинонов канал.
Пропастта в LH114-W бримката позволява образуването на непрекъсната мембранна област между вътрешното пространство на RC-LH114-W комплекса и обемната мембрана (Фигура 1G), вместо да свързва двата домена чрез протеинова пора, както е при протеините. RC-LH116 комплексът е подобен на затворен Tch. Игловиден комплекс (22) (Фигура 1H). Тъй като дифузията на хинон през мембраната е по-бърза от дифузията през тесния протеинов канал, отворената LH114-W бримка може да позволи по-бързо обръщане на RC, отколкото затворената LH116 бримка, а дифузията на хинон в RC може да бъде по-ограничена. За да проверим дали протеин W влияе върху превръщането на хиноните през RC, проведохме анализ на цитохромно окисление върху определена концентрация на убихинон 2 (UQ2) (аналог на естествения UQ10 с по-къса изопренова опашка) (Фигура 2E). Въпреки че наличието на хелатиран хинон възпрепятства точното определяне на видимата константа на Михаелис (RC-LH114-W и RC-LH116 са подходящи съответно за 0,2±0,1μM и 0,5±0,2μM), максималната скорост на RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) е с 28±5% по-голяма от тази на RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Първоначално изчислихме, че протеин-W присъства в около 10% от основния комплекс (16); тук степента на заетост на растежните клетки при слаба, средна и силна светлина е съответно 15±0,6%, 11±1% и 0,9±0,5% (Фигура 2F). Количественото сравнение на масспектрометрията показа, че добавянето на хистидинов маркер не намалява относителното изобилие на протеин-W в сравнение с щамовете от див тип (P = 0,59), така че тези нива не са артефакт на модифициран протеин-W (Фигура S10). Тази ниска заетост на протеин-W в RC-LH1 комплекса обаче може да позволи на някои RC да се преобразуват с ускорена скорост, като по този начин смекчат по-бавния обмен на хинон/хинолон в RC-LH116 комплекса. Забелязахме, че степента на заетост при висока светлина е несъвместима с последните транскриптомични данни, което показва, че експресията на гена pufW се увеличава при силна светлина (Фигура S11) (23). Разликата между транскрипцията на pufW и включването на протеин-W в RC-LH1 комплекса е объркваща и може да отразява сложната регулация на протеина.
В RC-LH114-W са разпределени и моделирани 6 кардиолипинови (CDL), 7 фосфатидилхолин (POPC), 1 фосфатидилглицерол (POPG) и 29 β-DDM молекули - 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG и 12 βDDM. RC-LH116 (Фигура 5, A и B). В тези две структури CDL е разположен почти изцяло от цитоплазмената страна на комплекса, докато POPC, POPG и β-DDM са разположени предимно от луминалната страна. Две липидни и детергентни молекули са изолирани в областта αβ-1 до αβ-6 на комплекса RC-LH114-W (Фигура 5A), а пет са изолирани в еквивалентната област на RC-LH116 (Фигура 5B). Повече липиди са открити от другата страна на комплекса, главно CDL, натрупани между RC и αβ-7 до αβ-13 (Фигура 5, A и B). Други структурно разделени липиди и детергенти са разположени извън LH1 пръстена, а добре разделени ацилни вериги се простират между LH1 субединици, предварително обозначени като β-DDM в RC-LH114-W и дефинирани като β-DDM в RC Смес от β-DDM и POPC-LH116. Подобните позиции на хелатните липиди и детергенти в нашата структура показват, че те са физиологично значими места за свързване (Фигура S12A). Позициите на еквивалентни молекули в Tch също имат добра консистенция. Gentle и Trv. Щам 970 RC-LH1s (Фигура S12, B до E) (9, 12) и водородните връзки на липидната главна група показват сравнително добра консервация в подравняването на последователността (Фигура S13), което показва, че консервираният CDL, който се свързва с RC (24), тези места могат да бъдат консервирани в RC-LH1 комплекса.
(A и B) Пептидите RC-LH114-W (A) и RC-LH116 (B) са представени с карикатури, а пигментите са представени с пръчици, използвайки цветовата схема на Фигура 1. Липидите са показани в червено, а детергентите са показани в сиво. UQ, свързан с RC QA и QB сайтове, е жълт, докато изолираният UQ е син. (C и D) Същите изгледи като (A) и (B), с пропуснати липиди. (E до G) Уголемено изображение на Q1(E), Q2(F) и Q3(G) от RC-LH116, със странични вериги, които си влияят взаимно. Водородните връзки са показани като черни пунктирани линии.
В RC-LH116, както RC QA, така и QB UQ, които участват в преноса на електрони в процеса на разделяне на заряда, са разложени в техните места на свързване. В RC-LH114-W обаче, QB хинонът не е разделен и ще бъде обсъден подробно по-долу. В допълнение към QA и QB хиноните, две хелатни UQ молекули (разположени между пръстените RC и LH1) са разпределени в структурата на RC-LH114-W според техните добре разделени главни групи (разположени съответно в Q1 и Q2). (Фигура 5C). Две изопренови единици са присвоени на Q1, а картата на плътността разделя пълните 10 изопренови опашки на Q2. В структурата на RC-LH116 са разделени три хелатни UQ10 молекули (Q1 до Q3, Фигура 5D) и всички молекули имат ясна плътност в цялата опашка (Фигура 5, D до G). В двете структури, позициите на хиноновите главни групи на Q1 и Q2 имат отлична консистенция (Фигура S12F) и взаимодействат само с RC. Q1 е разположен на входа на W празнината на RC-LH114-W (Фигура 1G и 5, C, D и E), а Q2 е разположен близо до мястото на свързване на QB (Фигура 5, C, D) и F). Консервираните остатъци L-Trp143 и L-Trp269 са много близки до Q1 и Q2 и осигуряват потенциални π-стакинг взаимодействия (Фигура 5, E и F, и Фигура S12). L-Gln88, на 3.0 Å от дисталния кислород на Q1, осигурява силна водородна връзка (Фигура 5E); този остатък е консервиран във всички RC с изключение на най-отдалечената връзка (Фигура S13). L-Ser91 е консервативно заместен с Thr в повечето други RC (Фигура S13), е на 3,8 Å от метиловия кислород на Q1 и може да осигури слаби водородни връзки (Фигура 5E). Q3 изглежда няма специфично взаимодействие, но е разположен в хидрофобната област между RC-M субединицата и LH1-α субединицата 5 до 6 (Фигура 5, D и G). Q1, Q2 и Q3 или близки хелатирани хинони също са били разделени в Tch. Gentle, Trv. Щам 970 и Blc. Структурата на ириса (9, 10, 12) сочи към запазен спомагателен сайт за свързване на хинони в RC-LH1 комплекса (Фигура S12G). Петте разложени UQ в RC-LH116 са в добро съответствие с 5.8±0.7 за всеки комплекс, определени чрез високоефективна течна хроматография (HPLC), докато трите разложени UQ в RC-LH114-W са по-ниски от . Измерената стойност от 6.2±0.3 (фиг. S14) показва, че в структурата има неразложени UQ молекули.
Псевдосиметричните L и M полипептиди съдържат по пет TMH и образуват хетеродимер, който комбинира един BChl димер, два BChl мономера, два бактериофагови (BPh) мономера и едно нехемово желязо и една или две UQ10 молекули. Чрез наличието на водородни връзки в крайната кетонна група и известното ѝ натрупване в Rps, каротеноидите се включват в M-субединицата, която се нарича цис-3,4-дехидрородопин. Видове (25). Външномембранният домейн на RC-H е закотвен към мембраната чрез един TMH. Цялостната RC структура е подобна на трисубединичната RC на сродни видове (като Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Макроклисите на BChl и BPh, каротеноидният скелет и нехемовото желязо се припокриват в рамките на диапазона на разделителна способност на тези структури, както и UQ10 главната група в QA мястото и QB хинонът в RC-LH116 (Фигура S15).
Наличието на две RC структури с различни скорости на запълване на QB местата предоставя нова възможност за изследване на последователните конформационни промени, съпътстващи свързването на QB хинон. В RC-LH116 комплекса, QB хинонът е разположен в напълно свързаната „проксимална“ позиция (26), но разделянето на RC-LH114-W няма QB хинон. В RC-LH114-W няма QB хинон, което е изненадващо, тъй като комплексът е активен, повече отколкото RC-LH116 комплексът със структурно разделен QB хинон. Въпреки че двата LH1 пръстена хелатират около шест хинона, пет са структурно разделени в затворения RC-LH116 пръстен, докато само три са структурно ограничени в отворения RC-LH114-W пръстен. Това повишено структурно разстройство може да отразява по-бързото заместване на QB местата на RC-LH114-W, по-бързата кинетика на хинона в комплекса и повишената вероятност за преминаване през LH1 бримката. Предполагаме, че липсата на UQ в RC QB сайта на RC-LH114-W може да е резултат от по-сложен и по-активен комплекс, а QB сайта на RC-LH114-W е незабавно замразен в UQ оборот. Специфичният етап (входът към QB сайта е затворен) отразява конформацията на тази активност.
Без QB, съпътстващото завъртане на L-Phe217 до позиция, несъвместима със свързването с UQ10, тъй като това ще предизвика пространствен сблъсък с първата изопренова единица на опашката (Фигура 6А). Освен това, очевидните основни конформационни промени са очевидни, особено спиралата de (къса спирала в бримката между TMH D и E), където L-Phe217 се измества към QB свързващия джоб и завъртането на L-Tyr223 (Фигура 6А), за да се прекъсне водородната връзка с рамката M-Asp45 и да се затвори входът на QB свързващото място (Фигура 6B). Спиралата de се завърта в основата си, Cα на L-Ser209 се измества с 0,33 Å, докато L-Val221Cα се измества с 3,52 Å. Няма наблюдавани промени в TMH D и E, които са наслагващи се и в двете структури (Фигура 6А). Доколкото ни е известно, това е първата структура в естествения RC, която затваря QB мястото. Сравнението с пълната (QB-свързана) структура показва, че преди хинонът да бъде редуциран, е необходима конформационна промяна, за да влезе в хинона. L-Phe217 се завърта, за да образува π-стекинг взаимодействие с главната група на хинона, а спиралата се измества навън, позволявайки на скелета на L-Gly222 и страничната верига на L-Tyr223 да образуват мрежа от водородни връзки със стабилна структура на водородните връзки (Фигура 6, A и C).
(A) Припокриваща се карикатура на холограмна (L верига, оранжево/M верига, магента) и апо (сива) структура, в която ключовите остатъци са показани под формата на пръчковидно изображение. UQ10 е представен с жълта лента. Пунктираната линия показва водородните връзки, образувани в цялата структура. (B и C) Повърхностно представяне на аполипопротеина и цялата пръстенна структура, като се подчертава кислородът от страничната верига на L-Phe217 в синьо и L-Tyr223 в червено, съответно. L субединицата е оранжева; M и H субединиците не са оцветени. (D и E) Аполипопротеин (D) и цели (E) RC QB сайтове [оцветени съответно от (A)] и Thermophilus thermophilus PSII (зелено, синьо с пластичен хинон; PDB ID: 3WU2) Подравняване (58).
Неочаквано, въпреки че са налични няколко структури на QB-дефицитни RC без LH1, конформационните промени, наблюдавани в това проучване, не са били докладвани преди това. Те включват структурата на изчерпване на QB от Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) и Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), всички от които са почти същите като тяхната цялостна QB структура. Внимателното изследване на 3PRC разкри, че детергентните молекули LDAO (лаурил диметил амин оксид) се свързват на входа на QB позицията, което може да предотврати пренареждането в затворена конформация. Въпреки че LDAO не се разлага на същата позиция в 1EYS или 1OGV, тези RC се приготвят с помощта на същия детергент и следователно могат да произведат същия ефект. Кристалната структура на Rba. Sphaeroides RC, кокристализиран с цитохром с2 (PDB ID: 1L9B), също изглежда има затворен QB сайт. В този случай обаче N-терминалният регион на RC-M полипептида (взаимодействащ с QB свързващия сайт чрез H връзката на Tyr остатъка върху Q спиралата) приема неестествена конформация и конформационната промяна на QB не е допълнително изследвана (30). Успокояващо е, че не сме наблюдавали този вид деформация на M полипептида в структурата RC-LH114-W, която е почти същата като N-терминалния регион на RC-LH116 RC. Трябва също да се отбележи, че след премахването на LH1 антената на базата на детергент, аполипопротеиновите RC в PDB бяха разтворени, което елиминира вътрешните хинонови пулове и липиди в празнината между RC и вътрешната повърхност на околния LH1 пръстен (31, 32). RC остава функционален, защото запазва всички кофактори, с изключение на разградимия QB хинон, който е по-малко стабилен и често се губи по време на процеса на приготвяне (33). Освен това е известно, че отстраняването на LH1 и естествените циклични липиди от RC може да окаже влияние върху функциите, като например съкратения живот на P+QB-състоянието с разделен заряд (31, 34, 35). Следователно, предполагаме, че съществуването на локалния LH1 пръстен, обграждащ RC, може да поддържа „затворения“ QB сайт, като по този начин запазва локалната среда близо до QB.
Въпреки че аполипопротеинът (без QB хинон) и пълната структура представляват само две моментни снимки на оборота на QB мястото, а не серия от събития, има индикации, че свързването може да бъде ограничено, за да се предотврати повторното свързване от хидрохинон, за да се инхибира инхибирането на субстрата. Взаимодействието на хинолол и хинон в близост до QB мястото на аполипопротеина може да е различно, което води до неговото отхвърляне от RC. Отдавна е предложено, че конформационните промени играят роля в свързването и редукцията на хиноните. Способността на замразените RC да редуцират хиноните след адаптация към тъмнината е нарушена (36); рентгеновата кристалография показва, че това увреждане се дължи на това, че QB хиноните са затворени в „дистална“ конформация на около 4,5 Å от активната проксимална позиция (26, 37). Предполагаме, че тази дистална конформация на свързване е моментна снимка на междинното състояние между аполипопротеина и пълната пръстенна структура, което следва първоначалното взаимодействие с хинона и отварянето на QB мястото.
Ретикулума тип II, открит в PSII комплекса на някои фототрофни бактерии и цианобактерии, водорасли и растения, има структурна и функционална консервация (38). Структурното подреждане, показано на Фигура 6 (D и E), подчертава сходството между PSII RC и QB сайта на бактериалния RC комплекс. Това сравнение отдавна е модел за изучаване на тясно свързаните системи за свързване и редукция на хинони. Предишни публикации предполагат, че конформационните промени са съпроводени с PSII редукция на хинони (39, 40). Следователно, като се има предвид еволюционната консервация на RC, този ненаблюдаван досега механизъм на свързване може да е приложим и за QB сайта на PSII RC в оксигенирани фототрофни растения.
Щамове Rps ΔpufW (небелязана pufW делеция) и PufW-His (C-терминален 10x His-маркиран протеин-W, експресиран от естествения pufW локус). palustris CGA009 беше описан в предишната ни работа (16). Тези щамове и изогенният родител от див тип бяха извлечени от фризера чрез нанасяне на малък брой клетки върху PYE (всеки 5 g литър -1) (съхраняван в LB при -80 °C, съдържащ 50% (w/v) глицеролов) протеин, дрождев екстракт и сукцинат) агар [1,5% (w/v)] плака. Плаката беше инкубирана за една нощ на тъмно при стайна температура при анаеробни условия и след това осветена с бяла светлина (~50 μmolm-2 s-1), осигурена от халогенни крушки OSRAM 116-W (RS Components, UK) в продължение на 3 до 5 дни, докато се появи единична колония. Единична колония е използвана за инокулиране на 10 ml от среда M22+ (41), допълнена с 0,1% (w/v) казаминокиселини (наричана по-долу M22). Културата е култивирана при условия на ниско съдържание на кислород на тъмно при 34°C с разклащане при 180 rpm в продължение на 48 часа, след което 70 ml от културата са инокулирани при същите условия в продължение на 24 часа. Полуаеробна култура с обем от 1 ml се използва за инокулиране на 30 ml от среда M22 в 30 ml универсална прозрачна стъклена бутилка с винтова капачка и се облъчва с разбъркване (~50μmolm-2 s-1) в продължение на 48 часа чрез стерилна магнитна бъркалка. След това 30 ml от културата са инокулирани с около 1 литър култура при същите условия, която след това е използвана за инокулиране на около 9 литра култура, осветена при ~200 μmolm-2 s-1 в продължение на 72 часа. Клетките бяха събрани чрез центрофугиране при 7132 RCF за 30 минути, ресуспендирани в ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) и съхранявани при -20°C до необходимост.
След размразяване, към ресуспендираните клетки, добавете няколко кристала дезоксирибонуклеаза I (Merck, Великобритания), лизозим (Merck, Великобритания) и две таблетки Roche холоензимен протеазен инхибитор (Merck, Великобритания). В клетка за френско налягане 20 000 psi (Aminco, САЩ), клетките бяха разрушени 8 до 12 пъти. След отстраняване на неразрушените клетки и неразтворимите остатъци чрез центрофугиране при 18 500 RCF за 15 минути при 4°C, мембраната беше утаена от пигментирания лизат чрез центрофугиране при 113 000 RCF за 2 часа при 43 000°C. Изхвърлете разтворимата фракция и ресуспендирайте оцветената мембрана в 100 до 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) и хомогенизирайте, докато няма видими агрегати. Суспендираната мембрана се инкубира в 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, САЩ), съдържаща 2% (w/v) β-DDM, в продължение на 1 час на тъмно при 4°C с леко разбъркване. След това се центрофугира при 70°C, за да се разтворят 150 000 RCF при 4°C в продължение на 1 час, за да се отстранят остатъчните неразтворими вещества.
Солубилизиращата мембрана от щама ΔpufW беше нанесена върху 50 ml DEAE Sepharose йонообменна колона с три колонни обема (CV) свързващ буфер [20 mM tris-HCl (pH 8.0), съдържащ 0.03% (w/v) β-DDM]. Колоната се промива с два CV свързващи буфера и след това се промива с два свързващи буфера, съдържащи 50 mM NaCl. RC-LH116 комплексът се елуира с линеен градиент от 150 до 300 mM NaCl (в свързващ буфер) при 1.75 CV, а останалият свързващ комплекс се елуира със свързващ буфер, съдържащ 300 mM NaCl при 0.5 CV. Събира се абсорбционният спектър между 250 и 1000 nm, като се поддържа фракцията със съотношение на абсорбция (A880/A280) по-голямо от 1 при 880 до 280 nm, разрежда се два пъти в свързващия буфер и се използва същата процедура отново върху DEAE колоната при пречистване. Разредете фракциите със съотношения A880/A280 по-високи от 1,7 и A880/A805 по-високи от 3,0, извършете третия кръг на йонен обмен и запазете фракциите със съотношения A880/A280 по-високи от 2,2 и A880/A805 по-високи от 5,0. Частично пречистеният комплекс беше концентриран до ~2 ml в центробежен филтър Amicon 100 000 molecular weight cut-off (MWCO) (Merck, UK) и зареден в колона за изключване по размер Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US), съдържаща 200 mM NaCl буфер, и след това елуиран в същия буфер при 1,5 CV. Съберете абсорбционните спектри на фракцията с изключване по размер и концентрирайте абсорбционните спектри със съотношения A880/A280 над 2,4 и A880/A805 над 5,8 до 100 A880, и ги използвайте незабавно за подготовка или съхранение на крио-ТЕМ мрежа. Съхранявайте при -80°C, докато е необходимо.
Солубилизиращата мембрана от щам PufW-His беше нанесена върху 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose колона (20 mM tris-HCl (pH 8.0), съдържаща 200 mM NaCl и 0.03% (w/w)) в IMAC буфер (GE Healthcare). v) β-DDM]. Колоната беше промита с пет CV IMAC буфер, а след това с пет CV IMAC буфер, съдържащ 10 mM хистидин. Основният комплекс беше елуиран от колоната с пет IMAC буфера, съдържащи 100 mM хистидин. Фракцията, съдържаща RC-LH114-W комплекса, беше концентрирана до ~10 ml в резервоар с разбъркване, оборудван с Amicon 100 000 MWCO филтър (Merck, UK), разредена 20 пъти със свързващ буфер и след това добавена към 25 ml. В DEAE Sepharose колоната, предварително се използват четири CV, свързани с буфера. Колоната се промива с четири CV свързващи буфера, след което комплексът се елуира върху осем CV с линеен градиент от 0 до 100 mM NaCl (в свързващ буфер), а останалите четири CV съдържат 100 mM свързващ буфер. Остатъчните комплекси, елуирани върху натриев хлорид, комбинирани със съотношение A880/A280 по-високо от 2,4 и съотношение A880/A805 по-високо от 4,6. Фракциите се концентрират до ~2 ml в центробежен филтър Amicon 100 000 MWCO и се напълват с 1,5 CV IMAC предварително в буферно уравновесена колона за изключване по размер Superdex 200 16/600, след което се елуират в същия буфер върху 1,5 CV. Събират се абсорбционните спектри на фракциите с изключване по размер и се концентрират абсорбционните спектри със съотношения A880/A280 над 2,1 и A880/A805 над 4,6 до 100 A880, които се използват незабавно за приготвяне на замразена TEM мрежа или се съхраняват при -80°C до необходимост.
За приготвяне на нискотемпературни TEM мрежи беше използван потапящ се фризер Leica EM GP. Комплексът беше разреден в IMAC буфер до A880 от 50, след което 5 μl бяха заредени върху новозаредена с тлеещ разряд QUANTIFOIL 1.2/1.3 медна мрежа с въглеродно покритие (Agar Scientific, UK). Инкубирайте мрежата при 20°C и 60% относителна влажност за 30 s, след това я подсушете с попивателна вода за 3 s и след това я охладите в течен етан при -176°C.
Данните от RC-LH114-W комплекса бяха записани на eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) с микроскоп Titan Krios, който работи при ускоряващо напрежение 300kV, с номинално увеличение 130 000× и енергия от - Изберете междина от 20 eV. За запис на изображения в режим на броене с цел събиране на данни беше използван Gatan 968 GIF Quantum с K2 пиков детектор. Калибрираният размер на пиксела е 1,048 Å, а мощността на дозата е 3,83 e-Å-2s-1. Филмът беше събран за 11 секунди и разделен на 40 части. Използвана беше покритата с въглерод област за префокусиране на микроскопа и след това бяха събрани по три филма на отвор. Общо бяха събрани 3130 филма, със стойности на дефокусиране между -1 и -3μm.
Данните за комплекса RC-LH116 бяха събрани с помощта на същия микроскоп в Лабораторията за биоструктури Asterbury (Университет в Лийдс, Великобритания). Данните бяха събрани в режим на броене с увеличение от 130 k, а размерът на пиксела беше калибриран на 1.065 Å с доза от 4.6 e-Å-2s-1. Филмът беше записан за 12 секунди и разделен на 48 части. Общо бяха събрани 3359 филма, със стойности на дефокусиране между -1 и -3μm.
Цялата обработка на данните се извършва в Relion 3.0 конвейера (42). Използвайте Motioncorr 2 (43), за да коригирате движението на лъча чрез дозово претегляне, и след това използвайте CTFFIND 4.1 (44), за да определите параметъра CTF (функция за трансфер на контраст). Типични фотомикрографии след тези начални етапи на обработка са показани на Фигура 2. S16. Шаблонът за автоматичен избор се генерира чрез ръчно избиране на около 250 пиксела от 1000 частици в 250-пикселов кадър и без референтна двуизмерна (2D) класификация, като по този начин се отхвърлят онези класификации, които отговарят на замърсяването на пробата или нямат различими характеристики. След това е извършен автоматичен избор на всички микрофотографии и RC-LH114-W е 849 359 частици, а RC-LH116 комплексът е 476 547 частици. Всички избрани частици са преминали през два кръга на нереферентна 2D класификация и след всеки цикъл частиците, които отговарят на въглеродната зона, замърсяване на пробата, нямат очевидни характеристики или силно припокриващи се частици, се отхвърлят, което води до 772 033 (90,9%) и 359 678 (75,5%). Частиците са използвани за 3D класификация на RC-LH114-W и RC-LH116 съответно. Първоначалният 3D референтен модел е генериран с помощта на метода на стохастичен градиентен спускане. Използвайки първоначалния модел като референция, избраните частици са класифицирани в четири категории в 3D. Използвайки модела в тази категория като референция, извършете 3D рафиниране на частиците в най-голямата категория, след което използвайте първоначалния 15Å нискочестотен филтър, за да покриете зоната на разтворителя, добавете 6 пиксела с меки ръбове и последваща обработка на пикселите, за да коригирате предавателната функция на Gatan K2 модулацията на горния детектор. За набора от данни RC-LH114-W, този първоначален модел беше модифициран чрез премахване на силната плътност в краищата на маската (отделена от плътността на основния комплекс в UCSF Chimera). Получените модели (резолюциите на RC-LH114-W и RC-LH116 са съответно 3.91 и 4.16 Å) се използват като референция за втория кръг на 3D класификация. Използваните частици са групирани в началния 3D клас и не съдържат силна корелация със съседството. Припокриване или липса на очевидни структурни характеристики. След втория кръг на 3D класификация беше избрана категорията с най-висока резолюция [За RC-LH114-W, едната категория е 377 703 частици (44.5%), за RC-LH116 има две категории, общо 260 752 частици (54.7%), където те са еднакви само когато са подравнени след първоначалното завъртане с малка разлика]. Избраните частици се реекстрахират в 400-пикселова кутия и се рафинират чрез 3D рафиниране. Маската на разтворителя се генерира с помощта на първоначалния 15Å нискочестотен филтър, 3-пикселно разширение на картата и 3-пикселова мека маска. Използвайки рафиниране на CTF за всяка частица, корекция на движението за всяка частица и втория кръг на рафиниране на CTF за всяка частица, след всяка стъпка се извършват 3D рафиниране, маскиране на разтворителя и последваща обработка, за да се усъвършенства допълнително получената текстура. Използвайки граничната стойност на FSC (Коефициент на корелация на Фурие Шел) от 0,143, разделителната способност на крайните модели RC-LH114-W и RC-LH116 е съответно 2,65 и 2,80 Å. FSC кривата на крайния модел е показана на Фигура 2. S17.
Всички протеинови секвенции са изтеглени от UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) е използван за конструиране на хомоложен модел на RC, който съдържа протеиновите секвенции на RC-L, RC-M и RC-H, а кристалната структура на Rba. sphaeroides RC е използвана като шаблон (PDB ID: 5LSE) (46). Използвайте инструмента „fit map“ в UCSF Chimera, за да напаснете генерирания модел към картата (47), да подобрите протеиновата структура и да добавите кофактора [4×BChl a (име на остатък от мономерната библиотека = BCL), 2×BPh a (BPH), един или два вида UQ10 (U10), едно нехемово желязо (Fe) и един 3,4-дихидрохексакарбонилхолин (QAK)] с Coot (48). Тъй като QAK не е наличен в мономерната библиотека, той беше параметризиран с помощта на инструмента eLBOW в PHENIX (49).
След това беше конструирана LH1 субединицата. Първоначално, инструментът за автоматично конструиране в PHENIX (49) беше използван за автоматично конструиране на част от LH1 последователността, използвайки картата и LH1-α и LH1-β протеиновите последователности като входни данни. Изберете най-пълната LH1 субединица, извлечете я и я заредете в Coot, добавете ръчно липсващата последователност в нея и ръчно прецизирайте цялата структура, преди да добавите два BCl a (BCL) и спирилоксантин (CRT) [според съответния Rps. Плътността на LH1 комплекса и известното съдържание на каротеноиди. Видове (17)]. Копирайте пълната LH1 субединица и използвайте UCSF Chimera „Docking Map Tool“, за да я докирате в съседната немоделна област с LH1 плътност, след което я прецизирайте в Coot; повтаряйте процеса, докато всички LH1 субединици бъдат моделирани. За структурата RC-LH114-W, чрез извличане на неразпределената плътност в Coot, протеинът се сегментира от останалите непротеинови компоненти в USCF Chimera картата и инструментът Autobuild се използва за установяване на началния модел и моделирането на останалите субединици (protein-W). В PHENIX (49). Добавете всички липсващи последователности към получения модел в Coot (48) и след това ръчно прецизирайте цялата субединица. Останалата неразпределена плътност съответства на комбинацията от липиди (PDB мономерна библиотека ID на CDL = CDL, POPC = 6PL и POPG = PGT), β-DDM детергент (LMT) и UQ10 молекули (U10). Използвайте PHENIX оптимизация (49) и ръчна оптимизация в Coot (48), за да усъвършенствате целия начален модел, докато статистиката на модела и визуалното качество на съответствието не могат да бъдат допълнително подобрени. Накрая използвайте LocScale (50), за да изострите локалната карта, и след това изпълнете няколко други цикъла на моделиране на неразпределената плътност и автоматична и ръчна оптимизация.
Съответните пептиди, кофактори и други липиди и хинони, свързани в рамките на съответните им плътности, са показани на Фигури 1 и 2. S18 до S23. Статистическата информация за крайния модел е показана в Таблица S1.
Освен ако не е посочено друго, UV/Vis/NIR абсорбционните спектри са събрани на спектрофотометър Cary60 (Agilent, САЩ) на интервали от 1 nm от 250 nm до 1000 nm и време на интегриране от 0,1 s.
Разредете пробата в кварцова кювета с 2 mm път до A880 от 1 и съберете абсорбционния спектър между 400 и 1000 nm. Кръговите дихроични спектри бяха събрани на спектрополяриметър Jasco 810 (Jasco, Япония) на интервали от 1 nm между 400 nm и 950 nm при скорост на сканиране 20 nm min-1.
Моларният коефициент на екстинкция се определя чрез разреждане на основния комплекс до A880 от приблизително 50. Разредете обема от 10 μl в 990 μl свързващ буфер или метанол и незабавно съберете абсорбционния спектър, за да се сведе до минимум разграждането на BChl. Съдържанието на BChl във всяка метанолова проба се изчислява чрез коефициента на екстинкция при 771 nm от 54,8 mM-1 cm-1 и коефициентът на екстинкция се определя (51). Разделете измерената концентрация на BChl на 32 (RC-LH114-W) или 36 (RC-LH116), за да определите концентрацията на основния комплекс, която след това се използва за определяне на абсорбционния спектър на същата проба, събрана в буфера. Коефициент на екстинкция. За всяка проба са направени три повторни измервания и за изчисление е използвана средната абсорбция на максимума на BChl Qy. Коефициентът на екстинкция на RC-LH114-W, измерен при 878 nm, е 3280±140 mM-1 cm-1, докато коефициентът на екстинкция на RC-LH116, измерен при 880 nm, е 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 беше количествено определен съгласно метода в (52). Накратко, обратнофазова HPLC (RP-HPLC) беше проведена с помощта на HPLC системата Agilent 1200. Разтворете около 0,02 nmol RC-LH116 или RC-LH114-W в 50 μl 50:50 метанол:хлороформ, съдържащ 0,02% (w/v) железен хлорид, и инжектирайте предварително уравновесената Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm. Разтворете в 1 ml-1 min-1 при 40°C в HPLC разтворител (80:20 метанол:2-пропанол) върху колона ×25 cm. Извършете изократно елуиране в HPLC разтворител, за да наблюдавате абсорбцията при 275 nm (UQ10), 450 nm (каротеноиди) и 780 nm (BChl) в продължение на 1 час. Пикът в хроматограмата при 275 nm на 25,5 минути беше интегриран, като не съдържаше други откриваеми съединения. Интегрираната площ се използва за изчисляване на моларното количество екстрахиран UQ10 спрямо калибрационната крива, изчислена от инжектирането на чисти стандарти от 0 до 5,8 nmol (Фигура S14). Всяка проба беше анализирана в три повторения и отчетената грешка съответства на стандартното отклонение (SD) на средната стойност.
Разтвор, съдържащ RC-LH1 комплекса с максимална Qy абсорбция от 0,1, беше приготвен с 30 μM редуциран цитохром c2 от конско сърце (Merck, UK) и от 0 до 50 μMUQ2 (Merck, UK). Приготвени бяха три проби от 1 ml при всяка концентрация на UQ2 и инкубирани за една нощ на тъмно при 4°C, за да се осигури пълна адаптация към тъмнината преди измерването. Разтворът беше зареден в модулен спектрофотометър OLIS RSM1000, оборудван с решетка с пламък 300 nm/500 линии, вход 1,24 mm, среден 0,12 mm и изходен отвор 0,6 mm. На входа на фотоепруветката за проба и референтната фотоумножителна тръба е поставен филтър с дължина на пропускане 600 nm, за да се елиминира възбуждащата светлина. Абсорбцията беше наблюдавана при 550 nm с време за интегриране 0,15 s. Възбуждащата светлина се излъчва от 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) чрез оптичен кабел с 90% интензитет чрез контролер DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) и се излъчва към източника на светлина под ъгъл от 90°. Измервателният лъч е насочен срещу огледалото, за да върне всяка светлина, която първоначално не е била абсорбирана от пробата. Следете абсорбцията 10 s преди осветяването от 50 s. След това абсорбцията се наблюдава допълнително в продължение на 60 s на тъмно, за да се оцени степента, до която хинололът спонтанно редуцира цитохром c23+ (вижте Фигура S8 за суровите данни).
Данните бяха обработени чрез апроксимиране на линейна начална скорост в рамките на 0,5 до 10 s (в зависимост от концентрацията на UQ2) и осредняване на скоростите на всичките три проби при всяка концентрация на UQ2. Концентрацията на RC-LH1, изчислена чрез съответния коефициент на екстинкция, беше използвана за преобразуване на скоростта в каталитичната ефективност, нанесена графично в Origin Pro 2019 (OriginLab, САЩ) и апроксимирана с модела на Michaelis-Menten, за да се определят видимите стойности на Km и Kcat.
За измервания на преходна абсорбция, пробата RC-LH1 беше разредена до ~2μM в IMAC буфер, съдържащ 50 mM натриев аскорбат (Merck, САЩ) и 0.4 mM тербутин (Merck, САЩ). Аскорбиновата киселина се използва като жертвен донор на електрони, а терт-бутаклофенът се използва като QB инхибитор, за да се гарантира, че основният RC донор остава редуциран (т.е. не е фотоокислен) по време на целия процес на измерване. Приблизително 3 ml от пробата се добавят към персонализирана въртяща се клетка (с диаметър около 0.1 m, 350 RPM) с дължина на оптичния път 2 mm, за да се гарантира, че пробата в лазерния път има достатъчно време за адаптация към тъмнината между възбуждащите импулси. Използвайте лазерни импулси с продължителност ~100 fs, за да усилите Ti:Sapphire лазерната система (Spectra Physics, САЩ), за да възбудите пробата при 880 nm с честота на повторение 1 kHz (20 nJ за NIR или 100 nJ за Vis). Преди събиране на данни, изложете пробата на възбуждаща светлина за около 30 минути. Експозицията ще доведе до инактивиране на QA (евентуално намаляване на QA веднъж или два пъти). Но имайте предвид, че този процес е обратим, защото след дълъг период на адаптация към тъмнината, RC бавно ще се върне към QA активност. За измерване на преходни спектри със закъснение от -10 до 7000 ps беше използван спектрометър Helios (Ultrafast Systems, САЩ). Използвайте софтуера Surface Xplorer (Ultrafast Systems, САЩ), за да разгрупирате наборите от данни, след което да ги обедините и стандартизирате. Използвайте софтуерния пакет CarpetView (Light Conversion Ltd., Литва), за да използвате комбинирания набор от данни, за да получите диференциални спектри, свързани с разпадането, или използвайте функция, която конволвира множество експоненти с отговора на инструмента, за да се съобрази със спектралната еволюция с една дължина на вълната в Origin (OriginLab, САЩ).
Както бе споменато по-горе (53), беше приготвен фотосинтетичен филм, съдържащ LH1 комплекс, лишен както от RC, така и от периферна LH2 антена. Мембраната беше разредена в 20 mM tris (pH 8.0) и след това заредена в кварцова кювета с 2 mm оптичен път. Използван е 30nJ лазерен импулс за възбуждане на пробата при 540 nm с време на закъснение от -10 до 7000 ps. Обработете набора от данни, както е описано за Rps.pal проба.
Мембраната се пелетизира чрез центрофугиране при 150 000 RCF в продължение на 2 часа при 4°C, след което абсорбцията ѝ при 880 nm се ресуспендира в 20 mM tris-HCl (pH 8,0) и 200 mM NaCl. Мембраната се разтваря чрез бавно разбъркване в 2% (w/v) β-DDM в продължение на 1 час на тъмно при 4°C. Пробата се разрежда в 100 mM триетиламониев карбонат (pH 8,0) (TEAB; Merck, UK) до концентрация на протеин от 2,5 mg ml-1 (Bio-Rad анализ). По-нататъшната обработка се извършва по предварително публикувания метод (54), започвайки с разреждане на 50 μg протеин в общо 50 μl TEAB, съдържащ 1% (w/v) натриев лаурат (Merck, UK). След ултразвукова обработка в продължение на 60 секунди, тя беше редуцирана с 5 mM трис(2-карбоксиетил)фосфин (Merck, UK) при 37°C за 30 минути. За S-алкилиране, пробата се инкубира с 10 mM метил S-метилтиометансулфонат (Merck, UK) и се добавя от 200 mM изопропанолов основен разтвор за 10 минути при стайна температура. Протеолитичното разграждане беше проведено чрез добавяне на 2 μg трипсин/ендопротеиназа Lys-C смес (Promega UK) и инкубиране при 37°C за 3 часа. Лауратното повърхностно активно вещество беше екстрахирано чрез добавяне на 50 μl етилацетат и 10 μl 10% (v/v) трифлуорооцетна киселина (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) с LC клас и вортексиране за 60 секунди. Фазовото разделяне беше подпомогнато чрез центрофугиране при 15 700 RCF за 5 минути. Съгласно протокола на производителя, за внимателно аспириране и обезсоляване на долната фаза, съдържаща пептида, е използвана спинова колона C18 (Thermo Fisher Scientific, Великобритания). След изсушаване чрез вакуумно центрофугиране, пробата е разтворена в 0,5% TFA и 3% ацетонитрил и 500 ng са анализирани чрез нанопоточна RP хроматография, съчетана с масспектрометрия, като са използвани системните параметри, описани по-рано.
Използвайте MaxQuant v.1.5.3.30 (56) за идентифициране и количествено определяне на протеини, за да търсите базата данни за протеоми на Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Данните от протеомиката чрез масспектрометрия са депозирани в ProteomeXchange Alliance чрез партньорското хранилище PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) под идентификатора на набора от данни PXD020402.
За анализ чрез RPLC, съчетана с електроспрей йонизационна масспектрометрия, RC-LH1 комплексът беше приготвен от див тип Rps. Използвайки предварително публикуван метод (16), концентрацията на протеин, получена в клетки на palustris, беше 2 mg ml-1 в 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl и 0.03% (w/v) β-(Bio-Rad анализ)) DDM. Съгласно протокола на производителя, използвайте 2D комплект за пречистване (GE Healthcare, САЩ) за екстрахиране на 10 μg протеин чрез метод на утаяване и разтворете утайката в 20 μl 60% (v/v) мравчена киселина (FA), 20% (v/v) ацетонитрил и 20% (v/v) вода. Пет микролитра бяха анализирани чрез RPLC (Dionex RSLC), съчетана с масспектрометрия (Maxis UHR-TOF, Bruker). Използвайте колона MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) за разделяне при 60°C и 100μlmin-1, с градиент от 85% (v/v) разтворител A [0.1% (v/v) FA и 0.02% (V/v) воден разтвор на TFA] до 85%(v/v) разтворител B [0.1%(v/v) FA и 0.02%(v/v) в 90%(v/v) ацетонитрил TFA]. Използвайки стандартен източник на електроспрей йонизация и параметри по подразбиране за повече от 60 минути, масспектрометърът получава от 100 до 2750 m/z (съотношение маса-заряд). С помощта на инструмента FindPept на портала за биоинформатични ресурси на ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), картографирайте масспектъра към субединиците на комплекса.
Клетките бяха култивирани в продължение на 72 часа под 100 ml NF-ниска (10μMm-2 s-1), средна (30μMm-2 s-1) или висока (300μMm-2 s-1) светлина. Среда M22 (среда M22, в която амониевият сулфат е пропуснат, а натриевият сукцинат е заменен с натриев ацетат) в 100 ml бутилка с винтова капачка (23). В пет цикъла от по 30 секунди, стъклени перли с размер 0,1 микрона бяха добавени в обемно съотношение 1:1 за лизиране на клетките и охладени върху лед за 5 минути. Неразтворимата материя, неразрушените клетки и стъклените перли бяха отстранени чрез центрофугиране при 16 000 RCF за 10 минути в настолна микроцентрофуга. Мембраната беше разделена в Ti 70.1 ротор със 100 000 RCF в 20 mM tris-HCl (pH 8,0) с 40/15% (w/w) градиент на захароза в продължение на 10 часа.
Както е описано в предишната ни работа, имунодетекция на His маркера върху PufW (16). Накратко, пречистеният ядрен комплекс (11.8 nM) или мембраната, съдържаща същата концентрация на RC (определена чрез окисление, изваждане на редуцирания диференциален спектър и съпоставяне на натоварването върху оцветения гел) в 2x SDS зареждащ буфер (Merck, UK), разреден два пъти. Протеините бяха разделени на реплика 12% bis-tris NuPage гел (Thermo Fisher Scientific, UK). Гел беше оцветен с Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) за зареждане и визуализиране на RC-L субединицата. Протеинът върху втория гел беше прехвърлен върху метанол-активирана поливинилиден флуоридна (PVDF) мембрана (Thermo Fisher Scientific, UK) за имуноанализ. PVDF мембраната беше блокирана в 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 и 5% (w/v) обезмаслено мляко на прах, след което инкубирана с първичното антитяло anti-His (в буфер за разреждане на антитялото [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl и 0.05% (v/v) Tween-20] в 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, САЩ) в продължение на 4 часа. След 3 промивания в продължение на 5 минути в буфер с антитела, мембраната беше комбинирана с вторично антитяло срещу мишка от хрянова пероксидаза (Sigma-Aldrich, Великобритания) (разредено 1:10 000 в буфер с антитела). Инкубирайте, за да се позволи откриване (5 минути след 3 промивания в буфер с антитела), използвайки хемилуминесцентен субстрат WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Италия) и Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Великобритания).
Чрез начертаване на разпределението на интензитета на всеки оцветен гел или имуноанализ, интегриране на площта под пика и изчисляване на съотношението на интензитета на RC-L (оцветен гел) и Protein-W (имуноанализ), в ImageJ (57) обработете изображението. Тези съотношения бяха преобразувани в моларни съотношения, като се приеме, че съотношението на RC-L към protein-W в чистата проба RC-LH114-W е 1:1 и се нормализира целият набор от данни съответно.
За допълнителни материали към тази статия, моля, вижте http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Това е статия с отворен достъп, разпространявана съгласно условията на лиценза Creative Commons Attribution. Статията позволява неограничено използване, разпространение и възпроизвеждане във всякакъв носител, при условие че оригиналната творба е правилно цитирана.
Забележка: Молим ви да предоставите имейл адреса си само за да знае човекът, когото препоръчвате на страницата, че искате да види имейла и че не е спам. Няма да събираме никакви имейл адреси.
Този въпрос се използва, за да се провери дали сте посетител и да се предотврати автоматичното изпращане на спам.
Дейвид Дж. К. Суейнсбъри, Парк Циен, Филип Дж. Джаксън, Кейтлин М. Фарис, Дариуш М. Нидзвиедзки, Елизабет К. Мартин, Дейвид А. Фармър, Лорна А. Малоун, Ребека Ф. Томпсън, Нийл А. Рансън, Даниел П. Каниф, Марк Дж. Дикман, Дюи Холтън, Кристин Кирмайер, Андрю Хичкок, К. Нийл Хънтър
Структурата с висока резолюция на комплекса светлинен капан 1 в реакционния център предоставя нови прозрения за динамиката на хиноните.
Дейвид Дж. К. Суейнсбъри, Парк Циен, Филип Дж. Джаксън, Кейтлин М. Фарис, Дариуш М. Нидзвиедзки, Елизабет К. Мартин, Дейвид А. Фармър, Лорна А. Малоун, Ребека Ф. Томпсън, Нийл А. Рансън, Даниел П. Каниф, Марк Дж. Дикман, Дюи Холтън, Кристин Кирмайер, Андрю Хичкок, К. Нийл Хънтър
Структурата с висока резолюция на комплекса светлинен капан 1 в реакционния център предоставя нови прозрения за динамиката на хиноните.
©2021 Американска асоциация за напредък на науката. всички права запазени. AAAS е партньор на HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.